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Dec 24, 2023

Eine Pipeline für die malignitäts- und therapieunabhängige Beurteilung der Reaktion auf Krebsmedikamente mithilfe von Zellmassenmessungen

Band Kommunikationsbiologie

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1295 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die funktionelle Präzisionsmedizin bietet eine vielversprechende Ergänzung zur genombasierten Krebstherapieberatung, indem sie die Wirksamkeit von Medikamenten direkt an den Tumorzellen eines Patienten testet. Hier beschreiben wir einen Arbeitsablauf, der Einzelzellmassenmessungen mit Inline-Hellfeldbildgebung und auf maschinellem Lernen basierender Bildklassifizierung nutzt, um den klinischen Nutzen solcher Funktionstests für Krebs zu erweitern. Mithilfe dieser bild kuratierten Massenmessungen charakterisieren wir Massenreaktionssignale für 60 verschiedene Arzneimittel mit unterschiedlichen Wirkmechanismen über zwölf verschiedene Zelltypen hinweg und demonstrieren so eine verbesserte Fähigkeit, Reaktionen für mehrere langsam wirkende Arzneimittel im Vergleich zu Standardtests zur Lebensfähigkeit von Zellen zu erkennen. Darüber hinaus verwenden wir diesen Arbeitsablauf, um Arzneimittelreaktionen für verschiedene primäre Tumorprobenformate zu beurteilen, darunter Blut, Knochenmark, Feinnadelaspirate (FNA) und bösartige Flüssigkeiten. Alle Berichte werden innerhalb von zwei Tagen erstellt und die Ergebnisse entsprechen den klinischen Reaktionen des Patienten. Die Kombination aus hochauflösender Messung, breiter Anwendbarkeit auf Medikamente und bösartige Erkrankungen und der schnellen Rückgabe von Ergebnissen, die dieser Arbeitsablauf bietet, legt nahe, dass er sich gut für die Durchführung einer klinisch relevanten funktionellen Beurteilung der Reaktion auf Krebsmedikamente eignet.

Effektive Biomarker für die Präzisionsonkologie erfordern Messansätze, die nicht nur das Ansprechen eines Patienten auf die Therapie vorhersagen, sondern auch für die Datenerfassung im Rahmen der routinemäßigen klinischen Krebsbehandlung geeignet sind. Zu den wichtigsten Einschränkungen gehören begrenzte Mengen an Tumorproben für die Charakterisierung, biologische Heterogenität und die Notwendigkeit einer schnellen Rückgabe von Ergebnissen, um die klinische Verwertbarkeit sicherzustellen.

Genomische Biomarker sind zum Goldstandard für die Therapiewahl in der Präzisionsonkologie geworden und zeigen einen bemerkenswerten klinischen Nutzen für mehrere genau definierte genomische Veränderungen1,2,3. Jüngste klinische Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass der Umfang solcher genomisch gesteuerten Ansätze weiterhin begrenzt ist. Vor allem die Studie „Molecular Analysis for Therapy Choice“ (NCI-MATCH) des National Cancer Institute ergab, dass weniger als 20 % der Patienten aufgrund der Identifizierung einer umsetzbaren Mutation einer Therapie zugewiesen wurden4. Wenn man auch die Patientenergebnisse berücksichtigt, haben aktuelle Studien ergeben, dass etwa 5–7 % der Patienten einen klinischen Nutzen von genomspezifischen Therapien zeigen5,6. Darüber hinaus entwickeln Patienten, die zunächst auf die Behandlung ansprechen, häufig eine Resistenz. Zu diesem Zeitpunkt liefert die anschließende Analyse verwertbarer Mutationen selten zusätzliche Informationen als Leitfaden für die weitere Behandlung7. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Instrumenten, die genomische Ansätze ergänzen, um eine rationale Therapieauswahl für eine breitere Population von Krebspatienten zu ermöglichen.

Einen solchen Ansatz bietet die funktionelle Präzisionsmedizin8,9. Während molekulare, histologische und genomische Biomarker zur Vorhersage der Reaktion auf Krebsmedikamente auf Proxy-Messungen der Zellfunktion beruhen, um potenziell die Arzneimittelauswahl zu beeinflussen, misst die funktionelle Präzisionsmedizin stattdessen die Wirkung spezifischer Arzneimittel direkt auf lebende Zellen, die aus dem Tumor eines Patienten isoliert wurden. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass er einen wirklich personalisierten Biomarker für die potenzielle Arzneimittelwirksamkeit bietet. Der Bedarf an lebenden Zellen stellt die Tests jedoch vor besondere Herausforderungen, einschließlich der begrenzten Zellularität, die durch die klinisch am besten zugänglichen Probenformate geboten wird, dem Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen und einer schnellen phänotypischen Drift ex vivo. Aufgrund dieser Einschränkungen haben sich viele neuere Entwicklungsbemühungen in der funktionellen Präzisionsmedizin auf hämatologische Malignome konzentriert, bei denen der Zugang zu einer Fülle lebender Zellen aus einer frischen Tumorprobe routinemäßiger möglich ist10,11,12,13,14,15. Eine breitere Anwendung dieser Ansätze bei soliden Tumoren bleibt jedoch eine Herausforderung und erfordert häufig eine erweiterte Kultur, um die Zellen ex vivo zu vermehren, um Tests zur Arzneimittelreaktion zu ermöglichen16,17,18. Trotz der ermutigenden jüngsten Fortschritte bei der schnelleren Prüfung von Medikamenten an frisch isolierten soliden Tumorzellen19 müssen diese Biomarker noch in Arbeitsabläufe umgesetzt werden, die routinemäßige klinische Tests ermöglichen.

Zu den wichtigsten Anforderungen für einen breit anwendbaren Funktionstest für die Reaktion auf Krebsmedikamente gehören (1) Flexibilität: Der Test muss mit verschiedenen Tumorprobenformaten kompatibel sein, die im Rahmen der klinischen Standardversorgung gesammelt werden, und der Biomarker muss die Fähigkeit nachweisen, die Reaktion auf Medikamente zu erkennen verschiedene Klassen. (2) Empfindlichkeit und Robustheit: Der Assay muss in der Lage sein, subtile Veränderungen in Zellpopulationen aus sehr heterogenen Proben zu identifizieren. (3) Geschwindigkeit: Der Verlust der Zelllebensfähigkeit und eine schnelle phänotypische Drift ex vivo schließen langfristige Medikamentendosierungsstrategien vor der Beurteilung des Ansprechens oft aus. Darüber hinaus müssen die Testergebnisse in einem klinisch verwertbaren Zeitrahmen zurückgegeben werden, um die therapeutische Entscheidungsfindung, insbesondere bei Patienten mit fortgeschrittenen oder fortschreitenden Krankheiten, effektiv zu steuern.

Einzelzellmassenmessungen eignen sich hervorragend, um die translatorischen Anforderungen funktioneller Präzisionstests in der Medizin zu erfüllen. Als integrative biophysikalische Anzeige des Phänotyps hat sich gezeigt, dass sich die Zellmasse als Reaktion auf die Behandlung mit wirksamen Arzneimitteln schnell verändert, und als Einzelzellmessung können Populationen anhand einer relativ kleinen Anzahl von Zellen charakterisiert werden20,21,22,23 ,24. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Messungen der Zellmassenveränderung mit dem Ansprechen des Patienten auf die Behandlung bei einer Reihe von bösartigen Erkrankungen korrelieren23,24. Wie bei anderen funktionellen Messansätzen schränken jedoch die logistischen und technischen Herausforderungen bei der Durchführung dieser Messungen an lebenden Zellen ihre klinische Anwendbarkeit weiterhin ein.

Hier beschreiben wir einen End-to-End-Workflow, der den potenziellen Anwendungsbereich von einzelzellbasierten Arzneimittelreaktionstests erweitert, indem er die Machbarkeit der Verwendung dieses Ansatzes zur Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit in verschiedenen primären Probenformaten sowohl von hämatologischen als auch soliden Tumormalignitäten demonstriert (Abb. 1). Unter Verwendung von Versand- und Tumorzellisolationsprotokollen, die für verschiedene Probenformate spezifisch sind, werden lebensfähige Einzelzellsuspensionen erzeugt (Methoden). Nach einer medikamentösen Behandlung in vitro über Nacht werden die Massenverteilungen dieser Zellpopulationen mithilfe einer Mikrofluidikplattform gemessen, die einen suspendierten Mikrokanalresonator (SMR) enthält. Der SMR-Sensor ermöglicht hochpräzise Messungen der Zellmasse in einer einfachen Durchflusskanalkonfiguration, wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben25,26,27. Zusätzlich zu den Massenmessungen werden für jedes Partikel, das den Massensensor passiert, Hellfeldbilder gesammelt und anschließend mithilfe eines auf einem Faltungs-Neuronalen Netzwerk (CNN) basierenden Bildklassifikators mit Anmerkungen versehen, um sicherzustellen, dass nur einzelne interessierende Zellen für die nachgelagerte statistische Analyse verwendet werden. Dieser vollständige Arbeitsablauf weist eine robuste technische Reproduzierbarkeit auf (ergänzende Abbildung 1) und wird routinemäßig innerhalb von 2 Tagen abgeschlossen.

Schematischer Überblick über die gesamte Medikamententest-Pipeline, einschließlich Probenentnahme und -versand, b Tumorzellisolierung und Medikamenteninkubation über Nacht, c Einzelzell-Massendatenerfassung mit mehr als zwölf SMR-basierten Instrumenten mit verknüpfter Hellfeld-Bildgebung, nachgeschalteter Bildklassifizierung, d Statistik Analyse, E-Response-Aufruf und Ergebnisberichterstattung.

Mit dieser Pipeline kann, wie hier gezeigt, eine breite Palette von Therapien innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung getestet werden, mit dosisabhängigen Massenreaktionen für 60 verschiedene Medikamente mit unterschiedlichen Wirkmechanismen über verschiedene Zelllinien hinweg. Darüber hinaus demonstrieren wir die Machbarkeit der Durchführung dieser Messungen für verschiedene minimalinvasive Tumorprobenformate, die üblicherweise im Rahmen der klinischen Routineversorgung entnommen werden. Dazu gehören Blut, Knochenmark, Proben mit geringem Input wie Feinnadelaspirate (FNA) und bösartige Flüssigkeiten wie Pleuraergüsse. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass ein Test, der auf bildkommentierten Einzelzellmassenmessungen basiert, das Potenzial hat, einen breiten Nutzen zu bieten, robust gegenüber der biologischen Komplexität translatorisch relevanter klinischer Proben ist und in einem klinisch verwertbaren Zeitrahmen durchgeführt werden kann.

Um die Reaktion der Zellmasse auf die Behandlung mit ausreichender statistischer Signifikanz zu erfassen, nutzen wir das Durchflussformat von SMRs, das Massenmessungen einzelner Zellen ermöglicht23,24,25,26,27. Ein SMR-Sensor besteht aus einem aufgehängten Ausleger mit einem integrierten U-förmigen Mikrofluidikkanal28 (Abb. 1c). Wenn eine Zelle den integrierten Kanal passiert, ändert sich die Masse des Auslegers vorübergehend, was zu einer kurzen Änderung der Resonanzfrequenz proportional zur schwimmenden Masse der Zelle führt, die in diesem Artikel (Methoden) als „Masse“ bezeichnet wird. Das im Instrument implementierte Fluidsteuerungsschema (ergänzende Abbildung 2) ermöglicht uns zusammen mit dem SMR-Chip die konsistente Messung von Proben von 5000 Zellen aus einem Volumen von 50 μl in 10 Minuten.

Um das Ansprechen auf die Behandlung anhand einer Patientenprobe zu messen, isolieren wir zunächst die Krebszellen aus der Probe (Abb. 2a) und inkubieren die aliquotierten Zellen mit Medikamenten oder Medikamentenkombinationen (Methoden). Anschließend lassen wir die Zellpopulationen durch den Massensensor leiten, um ihre Zellmassen-Wahrscheinlichkeitsverteilungsfunktionen zu erfassen, die wir in diesem Artikel als Massenverteilungen bezeichnen werden. Als Beispiel zeigt Abb. 2a drei unterschiedliche Massenverteilungen – eine Referenzverteilung von mit Vehikel behandelten Zellen (grau) und zwei Verteilungen von mit Medikamenten behandelten Zellen (blau und lila). Wir vergleichen die Verteilungen der behandelten Zellen mit denen der Referenzzellen mithilfe der Earth Mover's Distance (EMD), einem Maß für statistische Ähnlichkeit, und quantifizieren den Unterschied als „Mass Response“-Signal (Abb. 2b, Methoden). Wir messen eine größere Massenreaktion bei divergierenden Massenverteilungen (höherer EMD-Wert, blau gegenüber grau) und eine kleinere Massenreaktion bei ähnlichen Massenverteilungen (niedrigerer EMD-Wert, lila gegenüber grau). Um eine malignitätsunabhängige Metrik zu erhalten, die für verschiedene Tumorprobentypen verwendet werden kann, normalisieren wir jede Einzelzellmassenmessung mit der mittleren Masse der mit Vehikel behandelten Zellen in der Probe, was zu einem einheitenlosen Massenreaktionssignal führt, das Massenveränderungen meldet (in Prozent) relativ zur Kontrolle (Abb. 2b).

a Zunächst werden isolierte Krebszellen dosiert und mit den zu testenden Medikamenten (blau und lila) oder der mit Vehikel behandelten Kontrolle (grau) inkubiert. Die Masse der einzelnen Zellen aus jeder Population wird mit dem SMR-Gerät gemessen, um die Massenverteilung der behandelten Zellen (blaue und violette Kurven) und der unbehandelten Referenzzellen (graue Kurve) zu bestimmen. b Massenverteilungen der behandelten und Referenzzellen werden verglichen, um die Massenreaktion auf die Behandlung zu bestimmen. Das Massenreaktionssignal ist der statistische Abstand zwischen den beiden Massenverteilungen, der mit der Entfernung des Erdbewegungsgeräts (Methoden) berechnet wird. Der Vergleich zweier ähnlicher Verteilungen (lila vs. grau) ergibt ein kleineres Massenreaktionssignal, während der Vergleich divergierender Verteilungen (blau vs. grau) zu einem größeren Massenreaktionssignal führt. c Schematische Darstellung des Aufbaus des Massenreaktionstests. Mit Vehikel behandelte Kontrollzellen werden sowohl vor als auch nach den Zellen gemessen, die mit den getesteten Arzneimitteln behandelt wurden. Dieser Ansatz ermöglicht die Messung eines Basismassenreaktionssignals zwischen zwei Kontrollpopulationen (Referenz vs. Kontrolle), das mögliche zeitlich variierende Massenänderungen aufgrund von In-vitro-Effekten erfasst. d Massenreaktionsdiagramm, das die Massenreaktionssignale der in (a) und (b) gezeigten Kontroll- und behandelten Zellen zeigt. 95 %-Konfidenzintervalle, dargestellt als über jedem Punkt überlagerte Linien, werden durch Bootstrapping unter Verwendung von Einzelzellmassendaten (Methoden) berechnet. Die p-Werte werden durch Vergleich der Massenreaktionsgrößendifferenz von TEST und CTRL mit einem „Entscheidungsgrenzwert“ von 3 % (Methoden) bestimmt. * bedeutet p < 0,05, ns bedeutet p > 0,05.

Wie bei anderen bevölkerungsbasierten statistischen Tests hängt die Genauigkeit der Massenreaktionsmessung davon ab, wie gut die untersuchten Zellpopulationen die wahre Verteilung in der Tumorprobe widerspiegeln. Um den Einfluss von Massenmessparametern wie Sensorrauschen und der Anzahl der gemessenen Zellen zu verstehen, haben wir Simulationen mit den in Abb. 2a gezeigten Daten durchgeführt (ergänzende Abb. 3a, b). Die Messung von mindestens 2500 Zellen zur Berechnung einer Massenverteilung begrenzt das Grundlinienrauschen im Massenreaktionssignal zwischen identischen Proben auf weniger als 1,5 % und die Standardabweichung der Massenreaktion auf weniger als 1 %, während die Messung auf einer Probe basiert Bei 500 Zellen betragen diese Parameter 3 bzw. 1 %.

Aufgrund der inhärenten biologischen Heterogenität von Patientenproben können die isolierten Einzelzellen innerhalb einer Probe unterschiedlich stark auf die Behandlung ansprechen. Daher ist die Signallinearität ein entscheidendes Attribut für die genaue Umsetzung der behandlungsinduzierten Massenänderung in eine lineare Massenreaktion, die über Proben, Medikamente und Behandlungsdosen hinweg verglichen werden kann. Zur Demonstration simulieren wir unterschiedliche Größen von Massenreaktionen, indem wir Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen zu den in Abb. 2a gezeigten behandelten und Referenzverteilungen beproben. Wir zeigen, dass das Massenantwortsignal eine lineare Funktion des Verhältnisses der antwortenden Zellen in der Probe ist (ergänzende Abbildung 3c).

Ein Hauptziel von Funktionstests besteht darin, die Durchführung von Messungen in kurzen Zeiträumen, idealerweise in weniger als 48 Stunden, zu ermöglichen und so die Auswirkungen einer möglichen phänotypischen Drift und Lebensfähigkeitsänderung der getesteten primären Krebszellen zu minimieren. Um genaue und zuverlässige Ergebnisse zum Ansprechen auf die Behandlung zu gewährleisten, messen wir mit Vehikel behandelte Zellen zweimal – sowohl vor als auch nach den behandelten Zellpopulationen –, um etwaige phänotypische Abweichungen im Verlauf der Massenmessung zu berücksichtigen, die beim Testen mehrerer Bedingungen einige Stunden dauern kann. Bei den meisten hier vorgestellten Arzneimitteln wird Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Auflösung verwendet, und daher dient die Behandlung mit DMSO (0,25 %) allein als Vehikelkontrolle. Massenmessungen von mit 0,25 % DMSO behandelten Zellen sind nicht von unbehandelten Zellen zu unterscheiden, was auf eine minimale Auswirkung von DMSO allein auf die Zellmasse schließen lässt (ergänzende Abbildung 1). Abbildung 2c zeigt den Aufbau des Messansatzes. Zunächst wird eine Population von mit Vehikel behandelten Zellen gemessen, um sie als „Referenz“-Verteilung zu verwenden. Dann werden die Zellen gemessen, die der Behandlung ausgesetzt waren. Mehrere Behandlungs-„Bedingungen“ können nacheinander nach den Referenzzellen gemessen werden, um ein Arzneimittelpanel zu testen. Schließlich wird ein zweiter Replikatzustand von mit Vehikel behandelten Zellen als „Kontrolle“ gemessen. Um behandlungsunabhängige Veränderungen in den mit Vehikel behandelten Zellen während der Messdauer zu quantifizieren, berechnen wir die Massenreaktion zwischen der mit Vehikel behandelten Kontroll- und Referenzverteilung (STRG in Abb. 2d). Um die Zellreaktion auf die Behandlung zu quantifizieren, berechnen wir die Massenreaktion zwischen den mit Arzneimitteln behandelten Zellen und den mit Vehikel behandelten Referenzzellen (TEST in Abb. 2d). Der Vergleich der TEST- und CTRL-Signale mithilfe von Bootstrapping29 zur Bestätigung einer Signalgrößendifferenz, die größer als ein „Entscheidungsgrenzwert“ ist, ergibt einen p-Wert für die Interpretation des Behandlungsreaktionsergebnisses (Methoden). Beispielsweise würde ein gemessener Abstand zwischen blauen und grauen Punkten in Abb. 2d, der größer als die Entscheidungsgrenze ist, mit einem entsprechend niedrigen p-Wert darauf hinweisen, dass mit dem getesteten Medikament behandelte Zellen ihre Masse im Vergleich zu den Kontrollzellen in einem signifikanten Ausmaß verändert haben. Ein hoher p-Wert, der die Hypothese ablehnt, würde stattdessen darauf hinweisen, dass die Behandlung nicht anspricht (violetter Punkt in Abb. 2d). In diesem Artikel definieren wir die Drei-Sigma-Entscheidungsgrenze30 als 3% über alle Messungen hinweg, was der dreifachen Standardabweichung des Abstands zwischen 500 Zellen entspricht, die wiederholt aus einer Zellpopulation entnommen wurden (ergänzende Abbildung 3a).

Um die Robustheit unseres Ansatzes zu testen, haben wir die zelluläre phänotypische Drift in Form eines Massenverlusts als Funktion der Zeit simuliert (ergänzende Abbildung 3d). Wir haben unterschiedliche Massenverlustraten pro Zeit für Zellen getestet, um die Grenzen der Messung zu ermitteln und die Reaktion der behandelten Zellen korrekt zu erfassen. Unter der Annahme einer linearen Rate der phänotypischen Drift als Funktion der Zeit stellen wir fest, dass für die korrekte Auflösung einer Massenreaktionsgröße von 5 % (relativ zur Kontrolle) eine phänotypische Drift der mit Vehikel behandelten Zellen weniger als 10 % betragen sollte. Wir haben für keine der hier gemeldeten Zelllinien oder Primärproben phänotypische Driftraten beobachtet, die diese Zahl überschreiten. Dennoch ermöglicht uns unser Ansatz, eine signifikante phänotypische Drift zu identifizieren, indem wir den Abstand zwischen den Referenz- und Kontrollzellen überwachen, wie als CTRL-Signal dargestellt (Abb. 2d). Wenn festgestellt wird, dass dieser Abstand mehr als 10 % beträgt, schließen wir, dass der Test aufgrund der hohen phänotypischen Drift nicht schlüssig ist.

Trotz der hohen Wirksamkeit kommerziell erhältlicher Zellanreicherungskits (Methoden) enthalten verarbeitete Primärtumorproben neben interessierenden Einzelzellen häufig auch biologische Ablagerungen und Zellaggregate. Da Massenmessungen allein nicht zwischen diesen verschiedenen Partikeltypen unterscheiden können, kann dieses zusätzliche Material die Fähigkeit beeinträchtigen, medikamenteninduzierte Veränderungen in der Massenverteilung zu erkennen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir Hellfeld-Bildgebung inline mit dem Massensensor implementiert (Abb. 1) mit direkt nachgeschalteter optischer Partikelerkennung in Echtzeit, um die Bildaufnahme auszulösen. Jede Massenmessung wird mit dem entsprechenden Hellfeldbild gepaart und mithilfe der CNN-basierten Bildklassifizierung mit Anmerkungen versehen. Diese Bildklassifizierung erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wird ein binärer CNN-Klassifikator verwendet, um zu identifizieren, welche Einzelzellereignisse akzeptiert und welche Nichteinzelzellereignisse abgelehnt werden sollen, wie z. B. Trümmer und Zellaggregate. Jedes akzeptierte Ereignis wird weiter als entweder eine intakte oder durchlässige Einzelzelle klassifiziert und jedes zurückgewiesene Ereignis wird mithilfe zweier zusätzlicher binärer CNN-Klassifikatoren entweder als Aggregat oder als Trümmer charakterisiert (Abb. 3a).

a Schematische Darstellung des mehrstufigen Bildklassifizierungsansatzes, der im in Abb. 1 dargestellten Workflow implementiert ist. Ein Eingabebild wird zunächst mit einem binären CNN-Klassifikator als akzeptiert oder abgelehnt klassifiziert, und anschließend werden alle akzeptierten Partikel entweder als intakt oder als intakt klassifiziert Die durchlässige Zelle und alle zurückgewiesenen Partikel werden mit zwei zusätzlichen binären CNN-Klassifikatoren entweder als Aggregat oder als Trümmer klassifiziert. Die eingefügten Bilder sind repräsentativ für jede Klasse. Die an jedem binären Entscheidungsknoten aufgeführten Prozentsätze in Klammern geben die kreuzvalidierten Modellleistungen an und listen jeweils die Präzisions- und Rückrufwerte auf (Methoden). b Violindiagramme, die die Massenverteilungen für eine vollständige Zellpopulation ohne Bildklassifizierung (weiß) sowie Partikel innerhalb der Population zeigen, die als Aggregate (lila), intakte Zellen (grau), durchlässige Zellen (rosa) oder Trümmer (blau) klassifiziert wurden ) für ein menschliches Lungenkrebszelllinienmodell (PC9) und eine menschliche multiple Myelomzelllinie (MM1S). c Die Einzelzellbildklassifizierung reduziert das Rauschen im Massenantwortsignal durch Reduzierung des Abtastfehlers. Zu Demonstrationszwecken nehmen wir 100 Mal zufällig Stichproben aus 1000 Zellen aus einem gemessenen Zustand mit und ohne Bildkuration und berechnen die mittlere Massenreaktion innerhalb dieser beiden Sätze, die den Stichprobenfehler mit und ohne Bildkuration darstellt. Wenn dies für alle in diesem Artikel vorgestellten Messungen wiederholt wird, einschließlich 3222 gemessener Bedingungen auf 13 verschiedenen Instrumenten, stellen wir fest, dass die Bildkuration den Stichprobenfehler im Durchschnitt um 16,2 % reduziert. Dargestellt ist ein Beispielpaar von Massenverteilungen mit (grau) und ohne (weiß) Bildkuration, das auf das Vorhandensein von Zellaggregaten und Trümmerpopulationen im ursprünglichen Messsatz hinweist, die anschließend durch den Bildkurationsprozess entfernt werden.

Wir haben die CNN-Modelle mithilfe manuell kuratierter Bilder jeder Klasse trainiert, die für eine Reihe von Zelllinien und Primärtumorproben gesammelt wurden, um die Generalisierbarkeit über verschiedene Probenformate hinweg sicherzustellen (Methoden). Bei Anwendung auf manuell kuratierte Bildsätze erreichen diese Modelle kreuzvalidierte Präzisions- und Erinnerungswerte von über 97 % für jede Bildklasse (Abb. 3a).

In diesem Trainingssatz werden Bilder mit kleinen Partikeln oder faserigem Material als Trümmer und Bilder mit klar segmentierten Zellclustern als Aggregate klassifiziert. Die Unterscheidung intakter und durchlässiger Zellen basiert hauptsächlich auf dem verringerten Kontrast, der bei Zellen auftritt, die vermutlich ihre Membranintegrität verloren haben. Dieser durch Hellfeld-Bildgebung beobachtete Kontrastverlust steht im Einklang mit Lebensfähigkeitsdaten, die parallel zur durchflusszytometrischen Beurteilung von DAPI gesammelt wurden, einem DNA-interkalierenden Farbstoff, der für die Kerne nicht lebensfähiger Zellen, die eine funktionierende Zellmembran verloren haben, besser zugänglich ist (ergänzende Abbildung). . 4).

Der Nutzen von bildkommentierten Einzelzellmassenmessungen wird deutlich, wenn man die Massenverteilungen jeder Partikelklasse für Zelllinien mit unterschiedlichen Grundmasseneigenschaften vergleicht (Abb. 3b). Menschliche Lungenkrebszellen (PC9) und menschliche multiple Myelomzellen (MM1S) weisen deutlich unterschiedliche zugrunde liegende Massenverteilungen auf. Angesichts dieser Variation wäre es für verschiedene Zelltypen nicht möglich, sich allein auf Massenmessungen zu verlassen, um einzelne Zellen im Vergleich zu Trümmern oder Aggregatereignissen auf der Grundlage von Universal Gating zu identifizieren. Im Gegensatz dazu bieten Bildanmerkungen und -klassifizierungen ein breit anwendbares Mittel zur Identifizierung von Partikeln von Interesse in verschiedenen Proben, wie aus den in diesen beiden Zelllinien beobachteten konsistenten Massentrends über Partikelklassen hinweg ersichtlich ist, wobei Zellaggregate die größte Masse aufweisen, gefolgt von intakten Zellen, durchlässige Zellen und Trümmer. Diese Flexibilität ermöglicht die Identifizierung einzelner Zellen zur weiteren Analyse, unabhängig von der zugrunde liegenden Struktur der Massenverteilung einer bestimmten Probe. Diese verbesserte Fähigkeit, Massenverteilungen einzelner Zellen zu charakterisieren, ist eine Schlüsselvoraussetzung für die zuverlässige Identifizierung von Behandlungsreaktionen. Um den Nutzen der verknüpften Bildgebung zu quantifizieren, haben wir den Stichprobenfehler zwischen zufälligen Teilmengen von Zellen verglichen, die entweder aus allen in einer Bedingung erfassten Massenmessungen oder nur aus den mit Anmerkungen versehenen Massenmessungen stammen, die von der Bildklassifizierung akzeptiert wurden (Abb. 3c). In 3222 verschiedenen Datensätzen, die für eine Reihe von Primärzellen und Zelllinien gesammelt wurden, stellten wir fest, dass die Bildkuration diese Stichprobenvariabilität deutlich verbesserte, mit einer durchschnittlichen Verringerung des Stichprobenfehlers um 16,2 % im Vergleich zu nicht kuratierten Messungen aus derselben Erkrankung. Interessanterweise schienen „Aggregate“-Ereignisse mehr Stichprobenfehler zu verursachen als „Debris“-Ereignisse, wenn jede Klasse einzeln betrachtet wurde (ergänzende Abbildung 4b, c). Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit der verknüpften Bildgebung, die Zuverlässigkeit der Probenahme einer zugrunde liegenden Massenverteilung zu verbessern, insbesondere im Zusammenhang mit sehr heterogenen Proben, bei denen nur eine begrenzte Teilmenge der Messungen einzelne Zellen sind.

Bei der Betrachtung von Veränderungen der Zellmasse, die als Reaktion auf die Behandlung auftreten können, definieren wir drei mögliche Kategorien im Zusammenhang mit dem Wirkungsmechanismus (MOA) eines Arzneimittels: (1) Veränderungen aufgrund eines Stillstands des Zellzyklus, (2) Veränderungen aufgrund einer Störung von Stoffwechselprozessen und (3) Veränderungen aufgrund eines Versagens der strukturellen Integrität der Zelle (Abb. 4a). Mithilfe grundlegender Annahmen über die Natur der einzelnen Arten von Arzneimittelreaktionsmechanismen können wir einfache Modelle erstellen, die die erwarteten Massenänderungen in einer Population einzelner Zellen veranschaulichen. Im Falle eines Stillstands des Zellzyklus erwarten wir, dass sich die Massenverteilung allmählich um die durchschnittliche neugeborene Zellmasse für den G0/G1-Stillstand oder um die durchschnittliche Zellmasse vor der Teilung für den G2/M-Stillstand konsolidiert (Abb. 4b). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass sich Störungen der Stoffwechselwege in Veränderungen der Einzelzellmasse äußern können31. Diese Effekte können zu anabolen oder katabolen Prozessen tendieren und zu größeren bzw. kleineren Zellen führen, wie schematisch in Abb. 4b dargestellt. Es wird erwartet, dass eine Störung der Zellstrukturintegrität zu den größten Massenveränderungen in einer Population führt, da diese Kategorie mit Apoptose und/oder Nekrose von Zellen im Einklang steht und der Massenverlust wahrscheinlich durch dramatische physikalische Veränderungen an Zellen wie den Verlust von Zellen verursacht wird Membranintegrität/Zytoplasma, Membranausblutung, Zellfragmentierung und andere Prozesse. Hier gehen wir davon aus, dass ein großer Massenverlust dazu führen wird, dass sich die Zellen von ihrer anfänglichen, mit Vehikel behandelten Verteilung hin zu einer minimal überlappenden Sekundärverteilung verschieben (Abb. 4b).

Therapien mit unterschiedlichen Wirkmechanismen (MOA) induzieren unterschiedliche charakteristische Massenreaktionssignaturen. Wie in (a) dargestellt, erfassen diese MOA-Signaturen Arzneimittelwirkungen, die grob in drei allgemeine Kategorien eingeteilt werden können, darunter Zellzyklusstillstand, Stoffwechselstörung oder Verlust der strukturellen Integrität. b Schematische Darstellung der Veränderungen in der Massenverteilung zwischen einer Kontrollpopulation (graue Füllung, gepunktete Linie) und einer mit Medikamenten behandelten Population (rote Füllung, durchgezogene Linie), verursacht durch G1-Arrest, G2-Arrest, katabolische Verschiebung, anabole Verschiebung oder Zellmembran Verlust. c Beispielhafte experimentelle Massenverteilungsänderungen als Reaktion auf die medikamentöse Behandlung entsprechend jedem schematischen Ergebnis, das direkt oben in (b) dargestellt ist. d Massenreaktionsmessungen, die mit drei verschiedenen Instrumenten gesammelt wurden (einzelne Punkte mit Fehlerbalken, die dem 95 %-Konfidenzintervall von EMD für jedes System entsprechen, definiert durch 5000 Zufallsproben von 2500 Zellen), entsprechend den direkt oben in (c) dargestellten experimentellen Daten.

Medikamente mit den hier beschriebenen MOAs sind relativ häufig, ebenso wie homogene Zelllinien, die auf diese Medikamente reagieren, was es uns ermöglicht, diese hypothetischen Modelle zu testen. Um das Massenreaktionsergebnis des G0/G1-Stillstands zu testen, setzten wir die menschliche Lungenkrebs-Zelllinie H1666 17 Stunden lang 10 uM Trametinib, einem MEK-Inhibitor, aus, der die meisten Zellen im frühen G1-Stillstand setzt (ergänzende Abbildung 5a)32. Erwartungsgemäß sahen wir, dass sich die Zellmassenverteilung im Vergleich zur Kontrolle nach unten verschob (Abb. 4c, d). Im Gegensatz dazu beobachten wir durch die 24-stündige Behandlung von MDA-MB-361-Zellen mit 10 nM Docetaxel, einem Mikrotubuli-Inhibitor, der die Zellteilung verhindert, eine signifikante Verschiebung der Masse nach oben (Abb. 4c, d und ergänzende Abb. 5b). Diese beiden Zellzyklus-Arrest-Phänotypen sind für die Aktivität vieler Medikamente, sowohl gezielter Inhibitoren als auch Chemotherapien, von zentraler Bedeutung, und die Massenreaktion löst diese Phänotypen in vielen Beispielen robust auf (ergänzende Abbildung 6). Um Daten zur Stoffwechselverzerrung zu erhalten, behandelten wir Zellen mit Cycloheximid, einem ribosomalen Inhibitor, oder Carfilzomib, einem Proteasom-Inhibitor, um den Stoffwechsel in Richtung Katabolismus bzw. Anabolismus zu verzerren. In L1210-Zellen, die 24 Stunden lang mit 400 nM Cycloheximid behandelt wurden, beobachten wir eine Abnahme der durchschnittlichen Zellmasse in der Population, was mit einer Hemmung der Proteinbiogenese vereinbar ist33. Wenn wir U266-Zellen betrachten, die 6 Stunden lang mit 50 nM des Proteasom-Inhibitors Carfilzomib behandelt wurden, beobachten wir stattdessen einen geringfügigen Anstieg der durchschnittlichen Zellmasse, was mit einer übermäßigen Proteinakkumulation vor der nachgeschalteten Zytotoxizität übereinstimmt (Abb. 4c, d)34. Als Beispiel für eine vollständige Strukturstörung verwendeten wir schließlich L1210-Zellen, die 10 Minuten lang mit 0,5 % Tween 20-Detergens behandelt wurden, was die Zellmembran durchlässig macht und zu 40 % in eine ansonsten gesunde Zellpopulation eindringt. Hier beobachten wir eine Abnahme des primären Massenpeaks, der lebende Zellen repräsentiert, und einen Anstieg des kleineren Peaks, der permeabilisierte Zellen repräsentiert (Abb. 4c, d). Dieselben Veränderungen der Massenverteilungen können für Zellen nach dem durch klinisch relevante Arzneimittel verursachten Zelltod beobachtet werden (ergänzende Abbildung 7).

Die Fähigkeit von Massenverteilungen, diese unterschiedlichen Reaktionsprofile zu erkennen, macht sie gut geeignet für die Erkennung von Arzneimittelreaktionen in heterogenen Primärproben. Die dynamische Natur dieser Massenveränderungsmechanismen, kombiniert mit der Heterogenität im Timing der zellulären Reaktion und der möglichen phänotypischen Drift ex vivo, bedeutet, dass die Darstellung dieser Mechanismen in einer Zellpopulation nicht unbedingt einheitlich ist. Selbst in homogenen Zelllinien wie PC9-Zellen, die mit Doxorubicin behandelt wurden, zeigen beispielsweise unterschiedliche Dosen des Arzneimittels zu einem einzigen Zeitpunkt, wie sich ein Massenreaktionssignal sowohl durch einen Stillstand des Zellzyklus als auch durch eine strukturelle Störung manifestieren kann, entweder allein oder gleichzeitig (ergänzende Abbildung). . 8).

Neben der Kompatibilität mit verschiedenen Arzneimittelmechanismen ist es bei der Betrachtung der Rolle der Massenreaktionsmessung in einer klinischen Pipeline auch wichtig, die Kompatibilität mit heterogenen Tumorzellproben nachzuweisen, die ein begrenztes Zeitfenster der phänotypischen Stabilität ex vivo aufweisen, in dem die Arzneimittelsensitivität möglich ist beurteilt werden. Daher ist es wichtig, die Auswirkungen der Arzneimittelkonzentration und -zeit sowie der zugrunde liegenden Reaktionsheterogenität auf die Massenreaktionswerte zu bewerten.

Der kanonische Ansatz zur Charakterisierung der Arzneimittelempfindlichkeit als Funktion von Dosis und Zeit ist die auf der Lebensfähigkeit basierende Dosis-Wirkungs-Kurve oder IC50-Kurve. Daher haben eine Reihe von Lebensfähigkeitsmarkern und -techniken (z. B. MTT, ATP, Durchflusszytometrie) Potenzial als funktionelle Biomarker für die Krebsbehandlung gezeigt, die Wirkung dieser Ansätze im Zusammenhang mit Primärtumorproben war jedoch häufig durch die Anzahl begrenzt Anzahl der benötigten Zellen und die für die Durchführung dieser Tests erforderliche Zeit1. Als etablierter Standard bieten IC50-Kurven jedoch einen nützlichen Vergleich und ein Modell zum Verständnis der Variablen, die die Arzneimittelreaktion der Zellen beeinflussen. IC50-Messungen erfassen den Dosisraum, um den Dosiswendepunkt zu definieren, oberhalb dessen ein Großteil der Zellen als Reaktion auf ein Medikament abstirbt. Der optimale Zeitpunkt für die Beurteilung der auf der Lebensfähigkeit basierenden Dosisreaktion wird typischerweise durch den Wirkstoffmechanismus und die untersuchte Zelllinie bestimmt. Bei schnell wirkenden Medikamenten reicht oft ein 24-Stunden-Zeitpunkt aus, um die zelluläre Empfindlichkeit genau zu bestimmen; Bei langsam wirkenden Medikamenten (z. B. Medikamenten, deren Wirkung durch einen Zellzyklusstopp entsteht) kann jedoch ein Zeitpunkt von 72 Stunden oder länger erforderlich sein.

Um zu bewerten, wie sich diese Dosiskonzentrations- und Zeitparameter auf die Zellmassenreaktion auswirken, haben wir diese Variablen unabhängig voneinander in Zelllinien moduliert, um ihre Wirkung zu verstehen. MM1S-Zellen, die über einen festgelegten Zeitraum (15 Stunden) mit verschiedenen Carfilzomib-Konzentrationen behandelt wurden, zeigten eine dosisabhängige Massenreaktion ähnlich den IC50-Kurven, die für dieselbe Zelllinie erfasst wurden (Abb. 5a). Wir haben auch festgestellt, dass sich die Massenreaktion im Laufe der Zeit als Reaktion auf eine feste Arzneimittelkonzentration ändert (Abb. 5b). Bei schnell wirkenden Arzneimitteln, die schnell Zytotoxizität hervorrufen, zeigt die Größe der Massenreaktion eine Dosisabhängigkeit, die mit Messungen des Lebensfähigkeitsverlusts übereinstimmt, die zu ähnlichen Zeitpunkten erfasst wurden (Abb. 5c und ergänzende Abb. 9a, b). Aufgrund der Fähigkeit, Signale vor dem Zelltod zu erkennen, kann die Massenreaktion jedoch die Auswirkungen langsam wirkender Medikamente lange vor einem 50-prozentigen Lebensfähigkeitsverlust erkennen, der zur Definition eines genauen IC50-Signals erforderlich ist (Abb. 5d und ergänzende Abb . 9c, d). Beispielsweise definieren im Fall von mit Paclitaxel behandelten PC9-Zellen 24-Stunden-Massenmessungen genau einen Dosis-Wirkungs-Wendepunkt, der wirksame Konzentrationen des Arzneimittels aufdeckt, obwohl bei allen getesteten Konzentrationen minimale Änderungen der Lebensfähigkeit beobachtet wurden und IC50-Messungen 72 Stunden dafür erforderten eine genauere Anzeige (Abb. 5d). Wenn dieser Vergleich zwischen 60 verschiedenen Arzneimitteln durchgeführt wird, die in 12 verschiedenen Zelllinien getestet wurden, wird der Wert dieses sich schnell manifestierenden Massenreaktionssignals deutlich (Abb. 5e und ergänzende Daten 1). Bei vielen Arzneimitteln, seien es zielgerichtete Kinasehemmer oder Chemotherapien, ist ein 24-Stunden-IC50-Wert mit einer gemessenen Massenreaktion vergleichbar, wobei sich ein massenbasiertes Signal bei den gleichen oder nur geringfügig niedrigeren Dosen des Arzneimittels entwickelt, als durch Lebensfähigkeitsmessungen beobachtet. Bei Arzneimitteln, die über langsamer wirkende Mechanismen wie den Stillstand des Zellzyklus wirken, definieren 24-Stunden-Massenreaktionsmessungen jedoch immer noch wirksame Arzneimittelkonzentrationen, wohingegen 24-Stunden-IC50-Messungen wenig Perspektive liefern. Stattdessen müssen IC50-Zeitpunkte von 72 Stunden oder länger genommen werden, um die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber solchen Arzneimitteln zu bestimmen (Abb. 5e). Diese Fähigkeit, arzneimittelinduzierte Veränderungen im zellulären Phänotyp schnell zu erkennen, ist besonders vorteilhaft im Zusammenhang mit Primärgewebemessungen, bei denen längerfristige Arzneimittelinkubationen aufgrund von Phänotypdrift und Lebensfähigkeitsverlust ex vivo nicht durchführbar sind.

Das Massenreaktionssignal variiert mit Änderungen der Dosis oder dem Zeitpunkt der Messung, ähnlich wie bei Messungen der Zelllebensfähigkeit. Massenreaktion von mit Carfilzomib behandelten MM1S-Zellen, gezeigt bei einer variierenden Dosis zu einem Zeitpunkt von 15 Stunden oder bei einem variierenden Zeitpunkt bei einer Dosis von 150 nM. Mehrere Punkte zeigen unabhängige Instrumente an, überlagerte Linien zeigen ein 95 %-Konfidenzintervall für die Massenreaktion an, das durch 5000 Zufallsstichproben von 2500 Zellen definiert wird. c MM1S-Zellen, die 15 Stunden lang mit dem schnell wirkenden Medikament Venetoclax behandelt wurden, und d PC9-Zellen, die 24 Stunden lang mit dem langsam wirkenden Medikament Paclitaxel behandelt wurden, wobei die Dosis-Wirkungs-Beziehung anhand der Masse verglichen wird (rote Achse, rote Quadrate zeigen repräsentative Massenreaktionsmessungen). überlagerte Linien zeigen 95 %-Konfidenzintervall an) oder durchflusszytometriebasierte Bewertung der Lebensfähigkeit unter Verwendung von DAPI und Annexin V (blaue Achse, blaue Kreise, überlagerte Linien zeigen 95 %-Konfidenzintervall an) (Methoden). e Heatmap, die eine Massenreaktion von Zelllinien (obere Legende) auf 60 verschiedene Medikamente zeigt und das Ausmaß der Reaktion (roter Gradient; bestimmt durch den Unterschied zwischen Kontroll- und Testbedingungen) für nach Rang geordnete Dosen mit 24-Stunden-IC50 (schwarz) vergleicht Linien) oder Langzeit-IC50-Werte (offene Kreise). Langzeit-IC50-Werte werden nur für Arzneimittel bereitgestellt, deren 24-Stunden-IC50 unendlich oder größer als die höchste für Tests verwendbare Konzentration ist. Die Medikamente sind auf der x-Achse nach ihren 24-Stunden-IC50-Werten geordnet. Beobachtbare Massenreaktionen bei Dosen unterhalb von Kurzzeit- und Langzeit-IC50-Messungen für eine bestimmte Zell-/Arzneimittelkombination weisen darauf hin, dass Massenveränderungen bei allen vorgestellten Arzneimitteln entweder mit dem Verlust der Lebensfähigkeit einhergehen oder ihm vorausgehen. *** bedeutet p < 0,001, ns bedeutet p > 0,05.

Während homogene Zelllinien einen guten Kontext für die Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften von Massenreaktionsmessungen bieten, sind sie kein guter Ersatz für die Heterogenität, die in Primärtumorproben beobachtet wird. Aus diesem Grund ist es wichtig, den Einfluss der Heterogenität auf Massenreaktionsmessungen zu bewerten. Diese Variable kann explizit untersucht werden, indem mit Arzneimittel und Vehikel behandelte Fraktionen derselben Zelllinie gemischt werden. Dies zeigt, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt die Massenreaktion proportional zum Anteil der reagierenden Zellen zunimmt (Abb. 6a). Um die heterogene Größenverteilung und Arzneimittelsensitivität in einer Primärprobe nachzubilden, ist ein komplexeres Modell erforderlich. Um die fraktionierte Empfindlichkeit unter Berücksichtigung dieser Heterogenität zu testen, verwendeten wir eine Mischung aus drei Zelllinien, von denen jede eine einzigartige Empfindlichkeit gegenüber einem einzelnen Medikament aufweist (Abb. 6b). Wenn wir die Reaktion bei Kombinationen aus einem Medikament gegenüber zwei oder drei Medikamenten beobachten, sehen wir eine additive Verschiebung der Massenreaktion, die ungefähr der Summe der Reaktionen für jedes Medikament als Monotherapie entspricht (Abb. 6b).

a Massenreaktionsmessungen an MM1S-Zellen, wobei Vehikelkontroll- und mit Carfilzomib behandelte Zellen nach der Behandlung gemischt wurden, um Zellpopulationen mit definierten Fraktionen reagierender Zellen zu erzeugen. b Eine 1:1:1-Kombination von MM1S-, H929- und KMS-12-PE-Zellen, die 15 Stunden lang entweder mit Einzel-, Doppel- oder Dreifachwirkstofftherapien behandelt wurden, was das additive Signal zeigt, das mit zunehmender empfindlicher Zellfraktion beobachtet wird als Reaktion auf eine Kombinationsbehandlung. Mehrere Punkte zeigen unabhängige Instrumente an, überlagerte Linien zeigen ein 95 %-Konfidenzintervall für die Massenreaktion an, das durch 5000 Zufallsstichproben von 2500 Zellen definiert wird. *** bedeutet p < 0,001, ns bedeutet p > 0,05.

Diese Ergebnisse zeigen ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen Massenreaktionsmessungen und anderen bestehenden Arzneimittelreaktionstests und zeigen, dass Massenreaktionen die Auswirkungen von Zeit, Dosis und Probenheterogenität genau charakterisieren können. Der höhere Informationsgehalt, den Einzelzell-Massenreaktionsmessungen bieten, und ihre einzigartige Fähigkeit, die Zellempfindlichkeit zu früheren Zeitpunkten vor dem Verlust der Lebensfähigkeit aufzulösen, bieten klare Vorteile bei der Charakterisierung primärer Tumorzellen, bei denen eine längerfristige Erhaltung der Zellen ex vivo nicht praktikabel ist.

Die Probenzusammensetzung und die Durchführbarkeit der Probenentnahme variieren je nach klinischem Probenformat erheblich und können sich auf die Einfachheit der Zellisolierung und -messung auswirken. Eine Funktionstest-Pipeline muss daher mit Proben kompatibel sein, die aus einer Vielzahl von Tumorzellkompartimenten entnommen wurden, um eine breite Anwendbarkeit bei bösartigen Erkrankungen aufrechtzuerhalten.

Frühere Arbeiten haben die Machbarkeit der Verwendung von Massenreaktionsmessungen zur Charakterisierung der Arzneimittelwirksamkeit für hämatologische Malignitätsprobenformate wie Blut und Knochenmark gezeigt21. Während wir einen ermutigenden Proof-of-Concept dafür lieferten, dass solche biophysikalischen Messwerte das Ansprechen von Patienten auf die Therapie genau vorhersagen können, veranlasste uns die technische Komplexität der Verarbeitung von Proben solider Tumoren zu testen, ob unser bildkommentierter Arbeitsablauf zur Massenmessung die Fähigkeit zur Charakterisierung der Arzneimittelempfindlichkeit aufrechterhalten kann Bietet außerdem die Geschwindigkeit, Robustheit und technische Reproduzierbarkeit, die für eine klinische Testpipeline erforderlich sind (ergänzende Abbildung 2b).

Um zunächst die Kompatibilität dieses Arbeitsablaufs mit hämatologischen Tumorproben zu demonstrieren, präsentieren wir Messungen einer peripheren Blutprobe eines Patienten mit Plasmazell-Leukämie (PCL) und eines Knochenmarkaspirats eines Patienten mit multiplem Myelom (MM) (Abb. 7a). , B). In beiden Fällen konnten bei einer Reihe von Therapien zelluläre Massenreaktionen beobachtet werden. Aus der PCL-Probe isolierte Tumorzellen mit vorherigem Nachweis der t(11;14)-Translokation zeigten eine dosisabhängige Reaktion auf Venetoclax als Monotherapie und in Kombination mit Bortezomib und Selinexor. Allerdings zeigten diese Zellen keine signifikante Massenreaktion auf Selinexor oder Bortezomib allein, was darauf hindeutet, dass die Reaktion hauptsächlich durch Venetoclax ausgelöst wurde. Dieser Patient war zuvor mit einer auf Venetoclax basierenden Therapie behandelt worden und zeigte fünf Monate lang ein gutes Ansprechen, was durch die Eradikation des t(11;14)-Klons in nachfolgenden diagnostischen Knochenmarksbiopsien angezeigt wurde. Aufgrund von Nebenwirkungen (Zytopenien) wurde die Behandlung jedoch nach fünf Monaten abgebrochen. Die Knochenmarkaspiratprobe eines Patienten mit rezidiviertem/refraktärem multiplem Myelom mit bekannter extramedullärer Beteiligung zeigte eine dosisabhängige Reaktion auf die Kombination von Selinexor, Carfilzomib und Dexamethason sowie auf die DCEP-Therapiekombination (Dexamethason, Cyclophosphamid, Etoposid und Cisplatin). ). Bei der Dosierung als Monotherapie wurde der größte Teil der bei der Kombinationstherapie beobachteten Massenreaktion durch die Gabe des Cyclophosphamid-Analogon Mafosfamid rekapituliert – einer spontan hydrolysierenden Verbindung, die die gleichen zwei Komponenten produziert wie metabolisiertes Cyclophosphamid35. Wie bei früheren prädiktiven Messungen beim multiplen Myelom stimmten die DCEP-Massenreaktionsmessungen mit der Abnahme des monoklonalen Serumproteins des Patienten und dem Ansprechen auf die Behandlung mit einer Salvage-Kombinationschemotherapie überein.

Massenreaktionsmessungen wurden für a durchgeführt: Plasmazell-Leukämie (PCL)-Zellen, die aus einer peripheren Blutprobe isoliert und 15 Stunden lang mit den aufgeführten Arzneimitteln behandelt wurden, und b Multiple Myelomzellen, die aus einer Knochenmarkaspiratprobe isoliert und 15 Stunden lang mit den aufgeführten Arzneimitteln behandelt wurden , c-Zellen, die aus Feinnadelaspiratproben (FNA) isoliert wurden, die aus einer Lungenmasse, einer Halsmasse und einer Weichteilknochenmasse bei drei verschiedenen Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Melanom bzw. Brustkrebs entnommen und behandelt wurden 20 Stunden lang mit den aufgeführten Arzneimitteln behandelt und d nicht-kleinzellige Lungenkrebszellen (NSCLC) aus einer Pleuraergussprobe isoliert und 20 Stunden lang mit den aufgeführten Arzneimitteln behandelt. Bei allen Diagrammen stellt jeder Punkt die in einem einzelnen Instrument gemessene Massenreaktion dar, wobei die Fehlerbalken dem 95 %-Konfidenzintervall für die Massenreaktion entsprechen, das durch 5000 Zufallsstichproben von 2500 Zellen definiert wird. *** bedeutet p < 0,001, ** bedeutet p < 0,01, * bedeutet p < 0,05, ns bedeutet p > 0,05.

Bei Patienten mit rezidivierten oder metastasierten bösartigen soliden Tumoren erfordert die klinische Beurteilung häufig die Entnahme fester Gewebeproben anstelle von Blut- oder Knochenmarksproben. Die Entnahme dieser Proben durch chirurgische Resektionen oder manchmal sogar durch Kernbiopsien ist angesichts der Größe und anatomischen Lage der metastatischen Läsionen und des Wunsches, unnötige invasive Eingriffe zu vermeiden, nicht durchführbar. Die Feinnadelaspiration (FNA), bei der im Vergleich zu Kernbiopsien Nadeln mit geringerem Profil verwendet werden, bietet eine minimalinvasive Alternative zur Probenentnahme und verringert das Risiko von Blutungen und Verletzungen36. Um einen maximalen klinischen Nutzen zu gewährleisten, wollten wir die Machbarkeit der Durchführung von Massenreaktionsmessungen anhand dieser FNA-Proben mit geringem Input ermitteln, die oft nur Zehntausende einzelner Zellen für die nachgelagerte Analyse ergeben.

Wir haben FNA-Proben von drei verschiedenen anatomischen Stellen gesammelt: einer Lungenmasse bei einer Patientin mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), einer Halsmasse bei einer Patientin mit Melanom und einer lytischen Knochenmasse des Weichgewebes bei einer Patientin mit Brustkrebs ( Abb. 7c). Die Gesamtzellausbeute betrug 115.000, 25.000 bzw. 120.000 Tumorzellen für die Lungen-, Knochen- und Halsmassen. Diese Proben zeigten eine Reihe von Zellmassenreaktionen auf Arzneimittel, wobei die Lungenmasse eine signifikante Massenreaktion auf Paclitaxel und Gemcitabin zeigte, die Halsmasse eine signifikante Massenreaktion auf eine Kombination aus Dabrafenib und Trametinib zeigte und die Weichteilknochenmasse keine signifikante Massenreaktion zeigte Reaktion auf Docetaxel oder Doxorubicin. Interessanterweise wurde der Patient mit NSCLC anschließend mit einer Kombination aus Carboplatin und Paclitaxel behandelt und zeigte eine deutliche klinische Reaktion, die mit der für diese Probe festgestellten Massenreaktion auf Paclitaxel übereinstimmt. Diese Messungen belegen die Machbarkeit der Durchführung des End-to-End-Workflows mit Gewebeformaten mit geringem Input und sind ein Hinweis darauf, dass die Pipeline mit der Durchführung von Medikamentenreaktionstests im Rahmen der Einschränkungen aktueller klinischer Managementstrategien für Patienten mit fortgeschrittenen bösartigen soliden Tumoren kompatibel ist.

Zusätzlich zu den disseminierten metastatischen Läsionen sammeln sich bei vielen Patienten mit fortgeschrittenem Krebs bösartige Flüssigkeiten in Form von Pleuraergüssen oder Bauchaszites an, die erhebliche Beschwerden verursachen und aus diagnostischen und therapeutischen Gründen zur Linderung der Symptome abgelassen werden müssen37. Da diese bösartigen Flüssigkeiten Tumorzellen enthalten, bieten sie ein weiteres potenzielles Probenformat für minimalinvasive Tests der Arzneimittelwirkung. Nach Standardprotokollen zur Anreicherung von Tumorzellen (Methoden) ergeben diese Proben häufig eine erhebliche Anzahl von Zellen für die Messung. Bei einem Patienten mit fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs beispielsweise ergab eine 150-ml-Probe eines bösartigen Pleuraergusses fast 170 Millionen Tumorzellen, mehr als genug, um Massenreaktionstests für eine Reihe von Arzneimitteln durchzuführen (Abb. 7d). Dieser Patient wurde aufgrund einer bestätigten MET-Exon-14-Skipping-Mutation mit Capmatinib behandelt, hatte jedoch zum Zeitpunkt der Ergusssammlung nicht auf diese Therapie angesprochen. Massenreaktionsmessungen, die an den aus der Ergussprobe isolierten Tumorzellen durchgeführt wurden, stimmten mit diesem klinischen Ergebnis überein und zeigten keine signifikante Massenreaktion auf Capmatinib über Dosen hinweg, die über mehrere Größenordnungen reichten. Allerdings reagierten diese Zellen im Allgemeinen nicht auf alle Behandlungen und zeigten signifikante und dosisabhängige Massenreaktionen unterschiedlichen Ausmaßes auf Therapien wie Paclitaxel, Docetaxel und Cisplatin (Abb. 7e und ergänzende Abb. 10a). In Übereinstimmung mit Zelllinienmessungen von langsamer wirkenden Taxan-Arzneimitteln – einschließlich Paclitaxel und Docetaxel – waren die für diese Arzneimittel festgestellten Massenreaktionen mit auf Durchflusszytometrie basierenden Lebensfähigkeitsmessungen, die für dieselbe Probe durchgeführt wurden, nicht beobachtbar (ergänzende Abbildung 10b). Diese Ergebnisse zeigen die Machbarkeit der Erfassung von Massenreaktionsmessungen mit bösartigen Flüssigkeitsproben und liefern ein Beispiel für die Heterogenität der Arzneimittelreaktion, die durch die direkte Messung primärer Tumorzellen aufgedeckt werden kann. Darüber hinaus demonstrieren sie das Potenzial dieses neuen Ansatzes zur Ergänzung bestehender genomischer Biomarker, die, wie im Fall dieses Patienten, nicht immer eine wirksame Therapie identifizieren.

Der hier vorgestellte Arbeitsablauf baut auf jüngsten Bemühungen in der funktionellen Präzisionsmedizin bei Krebs auf10,11,12,13,14,15,16,17 und bietet wichtige zusätzliche translationale Entwicklungen hin zu einer breit anwendbaren schnellen Therapieanleitung für die klinische Krebsbehandlung. Wir haben die Machbarkeit der Erfassung von Medikamentenreaktionsmessungen in zytoverdünnten und minimalinvasiven Probenformaten nachgewiesen, die zur Probenahme von soliden Tumoren wie FNA und bösartigen Flüssigkeiten verwendet werden, zusätzlich zu denen, die üblicherweise bei der Untersuchung hämatologischer Malignome, einschließlich Blut und Knochenmark, verwendet werden . Die hier beschriebenen technischen Verbesserungen, einschließlich der Bildklassifizierung zur Messungskuration und des statistischen Ansatzes, helfen bei der Identifizierung von Behandlungsreaktionen mithilfe einer begrenzten Anzahl von Zellen aus einer heterogenen und labilen Primärprobe. Die durch diese Fortschritte ermöglichte Reduzierung des Hintergrundrauschens in Primärproben trägt auch dazu bei, die Testdurchlaufzeit auf zwei Tage zu verkürzen, indem die zur Beobachtung der Reaktion erforderliche Dauer der Arzneimittelexposition begrenzt wird.

Wir haben nicht nur gezeigt, dass dieser Arbeitsablauf für verschiedene bösartige Erkrankungen und Probenformate von großem Nutzen ist, sondern auch dazu verwendet werden kann, Massenreaktionen für ein breites Spektrum an Therapien zu identifizieren. Trotz einzigartiger Wirkmechanismen und unterschiedlicher Auswirkungen auf die zellulären biophysikalischen Eigenschaften konnten durch Einzelzellmassenmessungen dosisabhängige Reaktionen in Zelllinien für alle hier getesteten Hauptwirkstoffklassen identifiziert werden. Darüber hinaus waren diese Massenreaktionen mit wenigen Ausnahmen innerhalb von 24 Stunden beobachtbar, oft bevor mit alternativen lebensfähigkeitsbasierten Messungen ein signifikantes Signal erkannt werden konnte. Bei außergewöhnlich langsam wirkenden Arzneimitteln wie dem Antimetaboliten 5-Fluorouracil war die Massenreaktion zwar erst etwa 48 Stunden nach der Behandlung zu beobachten, sie ging jedoch jeder beobachtbaren Veränderung der Lebensfähigkeit der Zellen voraus, die durch Durchflusszytometrie beurteilt wurde (ergänzende Abbildung 9c). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Massenreaktionsmessungen einen Grad an Generalisierbarkeit bieten, der mit bestehenden auf der Lebensfähigkeit basierenden Goldstandard-Assays zur Arzneimittelreaktion vergleichbar ist, und gleichzeitig in vielen Kontexten eine schnellere Antwortauslesung ermöglichen – ein wesentlicher Satz von Merkmalen bei der Charakterisierung heterogener klinischer Proben, die möglicherweise auftreten ex vivo einer schnellen phänotypischen Drift unterliegen38,39.

Wie bei anderen Ansätzen zur Messung der Arzneimittelwirkung gibt es bestimmte Einschränkungen bei der Verwendung der Massenreaktion zur schnellen Therapieführung. Aufgrund der in diesem Arbeitsablauf verwendeten Ansätze zur Tumorzellisolierung und Medikamentendosierung ist er beispielsweise für die Charakterisierung von Medikamenten mit Tumorzell-intrinsischen Wirkmechanismen optimiert. Therapien, die hauptsächlich über nicht zellinterne Mechanismen wirken, wie etwa antiangiogene Medikamente, die eine physiologische Umgestaltung erfordern (z. B. Bevacizumab) oder endokrine Therapien, die indirekt auf Hormonrezeptor-positive Krebsarten abzielen (z. B. Aromatasehemmer), sind derzeit mit diesem Arbeitsablauf nicht kompatibel . Bestimmte Therapiearten, einschließlich immunonkologischer Medikamente wie Checkpoint-Inhibitoren, erfordern jedoch möglicherweise weniger erhebliche Änderungen in der Pipeline, um wirksame Messungen der Arzneimittelwirkung durchzuführen. Obwohl diese Therapien über nicht-tumorzelleigene Mechanismen wirken, haben frühere Arbeiten gezeigt, dass die Einzelzellmasse auch einen Aufschluss über den Funktionszustand von Immunzellen gibt21,22. Der hier vorgestellte Arbeitsablauf eignet sich für die direkte Messung dieser immunzellintrinsischen Arzneimittelwirkungen.

Der Einzelzellencharakter dieser Massenmesspipeline bietet für die Zukunft zusätzliche technische Möglichkeiten. Beispielsweise wurde hier die verknüpfte Bildgebung zur Partikelklassifizierung und zur Qualitätsverbesserung von Massenmessdaten verwendet, aber der optische Zugriff, den diese Plattform bietet, ist mit weiteren verknüpften Einzelzell-Ausleseansätzen kompatibel, einschließlich Hellfeld-Bildanalyse zur Merkmalsextraktion oder Fluoreszenzdetektion zur Immunphänotypisierung . In Kombination mit Entwicklungen im Bereich der Fluidhandhabung können diese optischen Verbesserungen zu geringeren Anforderungen an die Zellzahl für zukünftige Versionen des Assays führen. Als zerstörungsfreie Methode können diese Einzelzellmassenmessungen auch vor verknüpften multiomischen Einzelzell-Molekülauslesungen erfasst werden, wie zuvor mit gepaarter scRNA-seq22 gezeigt wurde. In ähnlicher Weise können Massenreaktionsmessungen, die für eine Primärtumorprobe gesammelt wurden, zur Ergänzung der für denselben Patienten gesammelten genomischen Ergebnisse verwendet werden, entweder gleichzeitig, um die Vorhersagegenauigkeit zu verbessern, oder nachgelagert, um den optimalen Inhibitor für eine bestimmte genomische Veränderung auszuwählen. In beiden Fällen bieten Einzelzellmassenmessungen eine funktionelle Bewertung der therapeutischen Reaktion, um die zugrunde liegenden biologischen Determinanten der Arzneimittelempfindlichkeit weiter zu analysieren, was erhebliche potenzielle Vorteile sowohl für die klinische Entscheidungsfindung als auch für die Entwicklung von Krebsmedikamenten bietet.

Da es sich um einen Funktionstest handelt, der auf ein breites Spektrum bösartiger Erkrankungen und Arzneimittelmechanismen abzielt, stellt dieser Ansatz besondere Herausforderungen dar. Beispielsweise hängt der Umfang der für eine bestimmte Primärprobe möglichen Arzneimittelreaktionstests weitgehend von der Gesamtmenge der nach der Verarbeitung verfügbaren Tumorzellen ab. Wie in Abb. 7 und der ergänzenden Abb. 11 zu sehen ist, kann die Anzahl der getesteten Bedingungen daher zwischen eins und über 25 liegen. Diese Zellausbeute variiert je nach Probenformat und einzelnen Proben stark und ist ein wichtiger Gesichtspunkt bei der Entwicklung von Arzneimittelpanels Test für verschiedene Probentypen. Aus Primärproben isolierte Tumorzellen können auch in verschiedenen Proben eine sehr unterschiedliche Reinheit und Lebensfähigkeit aufweisen, ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt für die klinische Umsetzung dieses Arbeitsablaufs (Ergänzende Anmerkung 1).

Die Interpretation der Massenreaktionsdaten, die für diese Primärproben gesammelt wurden, ist ebenfalls ein zentraler Entwicklungsschwerpunkt dieses Ansatzes, der in die Klinik gelangt. Während wir uns hier auf eine einfache binäre Bewertung von Reaktion und Nicht-Reaktion auf der Grundlage eines statistischen Distanzvergleichs konzentriert haben, werden sich zukünftige Arbeiten auf den Wert der Berücksichtigung des Ausmaßes der Reaktion oder anderer Merkmale der Massenverteilung einzelner Zellen bei der Erfassung der Tiefe oder Haltbarkeit konzentrieren des klinischen Ansprechens. Um sicherzustellen, dass der Test klinisch relevante Reaktionen und Nichtreaktionen korrekt identifiziert, sind kontextgerechte Validierungsdatensätze erforderlich. Diese medikamenten- und malignitätsspezifischen Spezifikationen zur Entscheidungsgrenze stehen im Mittelpunkt mehrerer laufender prospektiver Studien zu akuter myeloischer Leukämie, multiplem Myelom und soliden Tumoren, einschließlich Brust- und Lungenkrebs (NCT04985357 und NCT03777410). Die hier gezeigte Arbeit hat die Integration dieses Tests in einen robusten und skalierbaren CLIA-zertifizierten Arbeitsablauf für diese und zukünftige klinische Validierungsstudien ermöglicht.

Dieser Nachweis der klinischen Machbarkeit stellt zusätzlich zu den grundlegenden Eigenschaften von Massenreaktionsmessungen – arzneimittel- und malignitätsunabhängiger Nutzen, Kompatibilität mit kleinen Probengrößen und schneller Durchlaufzeit – einen bedeutenden Schritt in Richtung der weitreichenden klinischen Wirkung eines Funktionstests auf den Patienten dar Pflege.

Wir verwenden die SMR-Technologie, um Einzelzellmessungen auf ähnliche Weise wie zuvor vorgestellt23,28 durchzuführen, bei Flussraten über 80 nl/s und mit einer Massengenauigkeit von weniger als 0,5 pg. Anders als in den vorherigen Studien handelt es sich bei dem für diese Studie verwendeten Messaufbau um ein integriertes Instrument, das den SMR-Sensor und die zugehörige Fluidik steuert. Zur Erfassung der in diesem Artikel präsentierten Daten wurden dreizehn identische SMR-Instrumente verwendet. Jedes Instrument ist mit einer druck- und strömungsbasierten Fluidsteuerung, einem Temperaturregler zum Stabilhalten des SMR-Chips bei Raumtemperatur, einem FPGA-Controller sowie kundenspezifischer Auslese- und Antriebselektronik zur Steuerung des SMR-Sensors und zur Aufzeichnung ähnlicher Daten ausgestattet beschrieben in Olcum et al.40, eine Bildgebungseinheit zur Aufnahme von Bildern einzelner Zellen, während diese durch das SMR fließen, und einen Computer zur Ausführung der Steuerungs- und Analysesoftware. Der SMR und die Untereinheiten im Prototyp werden durch kundenspezifische Software gesteuert, die in der LabView-Umgebung entwickelt wurde. Die Software führt den Techniker automatisch nacheinander durch die Schritte Kalibrierung, Flüssigkeitsvorbereitung, Zellmessung und Reinigung. Der Reinigungsschritt wird zwischen jedem gemessenen Medikamentenzustand durchgeführt, um eine Kontamination über mehrere Messungen hinweg zu verhindern. Die Einstellungen und Parameter der Messungen für die Instrumente sind bei allen SMR-Instrumenten identisch und werden von der Steuerungssoftware von einem lokalen Server abgerufen. Darüber hinaus ist die Steuerungssoftware mit automatischen Routinen wie Flow-Kick-Back zur Verhinderung von Verstopfungen, automatischer Probenbeladung zur Minimierung von Abfall und Reinigungsroutinen zur Erhöhung der Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit ausgestattet.

In dieser Arbeit verwenden wir die Earth Mover's Distance (EMD), auch als erste Wasserstein-Distanz bekannt, um den Unterschied der Massenverteilungen als „Massenreaktion“ zu quantifizieren. EMD verfügt über Eigenschaften einer idealen Metrik zur Quantifizierung von Unterschieden in zellulären Verteilungen41 wie Linearität, Translationsinvarianz und Symmetrie und ist robust gegenüber kleinen Verteilungsunterschieden aufgrund von Instrumentendrift, Messrauschen oder anderen Variabilitätsquellen42. Wie von Orlova et al.42 vorgeschlagen, erfüllt EMD alle oben genannten Anforderungen und ist rechnerisch effizient für die Ausführung eindimensionaler Daten wie Einzelzellmassenmessungen43.

Um das Massenreaktionssignal als normalisierte, dimensionslose Metrik zum Vergleich von Massenverteilungen zu definieren, führen wir die folgende Notation ein (Gleichung 1):

wobei X und Z sortierte Einzelzellmassenmessungen von mit Arzneimittel bzw. Vehikel behandelten Referenzzellen sind und \(N\) die Anzahl der Zellen in jeder Verteilung ist42. (Die Massenreaktion wird auch für Fälle berechnet, in denen X und Z unterschiedliche Größen haben. In der obigen Gleichung nehmen wir der Einfachheit halber N für beide an.)

Wir berechnen das 90 %-Konfidenzintervall des Massenantwortsignals mithilfe nichtparametrischer Bootstrap-Methoden, da wir keine Gauß-Verteilung (oder andere bekannte Verteilungen) für die Zellmasse erwarten können. Insbesondere wird die BCa-Methode (Bias-Corrected and Accelerated) verwendet, um Konfidenzintervalle mit genauen Abdeckungswahrscheinlichkeiten über den gesamten Bereich des Massenreaktionssignals abzuschätzen44. Für alle in diesem Artikel gemeldeten Massenantworten beträgt \(N=2500\) Zellen und die Anzahl der Bootstrap-Replikate für das Massenantwort-Konfidenzintervall \(R=5000\), sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.

Die vorgeschlagene Struktur zur Messung der Massenreaktion (Abb. 2c, d) ermöglicht es uns, die biologische Bedeutung des gemessenen Massenreaktionssignals zu testen, anstatt Einzelzellmessungen mithilfe eines statistischen Tests direkt zu vergleichen. Da die Anzahl der gemessenen Zellen (\(N\)) zur Darstellung jeder Zellpopulation in der Größenordnung von Tausenden liegt, können sich kleine Abweichungen in den Massenverteilungen aufgrund von Stichprobenfehlern, Instrumentenrauschen oder phänotypischer Drift als statistisch signifikant erweisen. Solche Abweichungen können jedoch statistisch signifikant sein, ohne ein biologisch bedeutsames Signal darzustellen45. Um dieses Problem zu umgehen, definieren wir die Teststatistik \(\theta\) als die Differenz zwischen zwei Massenreaktionssignalen, d. h. CTRL und TEST, wie in Abb. 2d gezeigt, und prüfen, ob \(\theta\) ist größer als die Grenze der Entscheidungsschwelle. Daher (Gl. 2):

wobei \(Y\) die sortierten Massenmessungen der mit Vehikel behandelten Kontrollzellen ist und \(X\) und \(Z\) wie oben definiert sind. Der zweite Term der Gleichung ist der Abstand zwischen Referenz- und Kontrollzellen, gemessen zu verschiedenen Zeitpunkten (Abb. 2c). Die Teststatistik ist somit der Abstand der mit Arzneimittel behandelten Zellen zu den mit Vehikel behandelten Referenzzellen im Verhältnis zur „phänotypischen Drift“ (falls vorhanden) in den Kontrollzellen über die Dauer des Tests. Auch ohne Drift erfasst der zweite Term das natürlich auftretende Rauschen, das bei der Schätzung des Abstands zwischen zwei endlichen Stichproben aus derselben Verteilung auftritt.

Um die Empfindlichkeit von Krebszellen gegenüber einer Behandlung zu testen, vergleichen wir das Signal \(\theta\) mit einem Schwellenwert \({\theta }_{0}\) – der biologisch bedeutsamen „Entscheidungsgrenze“ –, die für die Behandlung geeignet ist Klasse des zu bewertenden Arzneimittels. Im Allgemeinen ist es eine Herausforderung, nichtparametrische Hypothesentests für Nullwerte ungleich Null durchzuführen. Wie Chernick feststellte: „Besonders wichtig beim Hypothesentest ist die Verwendung asymptotischer Pivotstatistiken und die Zentrierung der Verteilung unter der Nullhypothese“46. In Übereinstimmung mit der Aussage verwenden wir die hier beschriebene Bootstrap-t-Methode. Unter Verwendung der Ableitung von Davison et al.29 führen wir einen Pivot ein, d. h. eine Kombination von Daten und Parametern, deren Verteilung unabhängig von einem zugrunde liegenden Modell ist (Gleichung 3).

Dabei ist \(\hat{\theta }\) das beobachtete Signal, \(\theta\) das (nicht beobachtbare) wahre Signal und \(S\) der Standardfehler von \(\hat{\theta }\ ). In dieser Formulierung ist \(T\) asymptotisch Gaußsch. In der hier vorgestellten Arbeit wird \(\hat{\theta }\) aus jeweils \(N=2500\) Zellen der Referenz-, Kontroll- und Testpopulationen gemessen. \(S\) wird unter Verwendung von \(r=19\) Bootstrap-Replikanten von \(\hat{\theta }\) geschätzt.

Um die Nullhypothese \({H}_{0}:\theta \le {\theta }_{0}\) zu testen, ersetzen wir \({\theta }_{0}\) durch \(\theta\ ) und der beobachtete Wert des Pivots unter der Null wird (Gleichung 4):

Um den Hypothesentest durchzuführen, vergleichen wir \({t}_{{{{{{\mathrm{obs}}}}}}}}\) mit einer Bootstrap-Simulation von \(T\) (Gleichung 5) :

wobei S* der geschätzte Fehler des Bootstrap-Replikanten ist, \({\hat{\theta }}^{* }\). Da \({S}^{* }\) wiederum von Bootstrap gefunden wird, haben wir eine „eingebettete Bootstrap“-Methode. Wir haben \(R=\,999\) Iterationen von \({\hat{\theta }}^{* }\)und für jede dieser \(r=\,19\) Iterationen verwendet, um \( {S}^{* }\).

Der \(p\)-Wert, d. h. die Wahrscheinlichkeit, das beobachtete Ergebnis zu erreichen, vorausgesetzt, die Nullhypothese ist wahr, ist dann (Gleichung 6):

wobei \(\Pr \left(x\right)\) die Wahrscheinlichkeit ist, dass \(x\) wahr ist und \(\#[{x}^{* }]\) die Anzahl der Bootstrap-Varianten ist, für die \ (x\) ist wahr. Für die gewählte Anzahl von Iterationen \(R\) beträgt der minimal erreichbare \(p\)-Wert 0,001. Wir vergleichen den resultierenden \(p\)-Wert mit dem üblichen Signifikanzniveau von 5 %, d. h. \(p\,{{{{{\rm{Wert}}}}}} \, < \, 0,05\), um festzustellen, ob die Nullhypothese abgelehnt werden kann.

Auf den SMR-Instrumenten gesammelte Bilder verschiedener Zelltypen wurden manuell kuratiert, um Trainingssätze mit mindestens 10.000 Bildern für jede Bildklasse (intakte Zelle, durchlässige Zelle, Trümmer und Aggregat) zu erstellen. Anschließend wurden drei verschiedene binäre Klassifizierungs-CNN-Modelle mithilfe der Keras-Bibliothek (2.3.1) in Python (3.7.7) generiert. Dazu gehören (1) ein Akzeptanz-/Ablehnungsmodell, das während des Trainings sowohl intakte als auch durchlässige Zellbilder als „akzeptierte“ Ereignisse und sowohl Trümmer- als auch Aggregatbilder als „abgelehnte“ Ereignisse nutzte, (2) ein intaktes/permeables Modell und (3) ein Aggregat-/Trümmermodell. Für das Training verwendeten wir Bildvergrößerung, um die Robustheit der endgültigen Modelle zu verbessern. Diese Erweiterung umfasste zufälliges vertikales und horizontales Spiegeln des Bildes, Helligkeitsanpassung und Drehung. Jedes Modell wurde mit 90 % der Bilder aus jedem kuratierten Trainingssatz trainiert, wobei die restlichen 10 % für die Kreuzvalidierung zum Testen der Modellleistung verwendet wurden. Die Präzision und der Rückruf dieser Kreuzvalidierung sind in Abb. 3 dargestellt. Die Bilder wurden in zwei Stufen klassifiziert, wobei zunächst der Akzeptier-/Abweisungs-Klassifikator verwendet wurde und dann akzeptierte Partikel mit dem intakten/durchlässigen Klassifikator und die zurückgewiesenen Partikel mit dem Trümmer-/Abweisungs-Klassifikator weiter kommentiert wurden. Aggregat.

A549-, PC9-, MDA-MB-361-, PA-TU-8902-, HT-29-, NCI-H1666-, NCI-H2228-, MM.1S-, MM.1R-, H929-, U266- und KMS-12-PE-Zellen wurden in gehalten ein Basismedium, ergänzt mit fötalem Rinderserum (FBS; Sigma Aldrich, Kat.-Nr. F4135), Antibiotika-Antimykotikum (Gibco, Kat.-Nr. 15240062) und HEPES (Gibco, Kat.-Nr. 15630080) und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C gelagert, 5 % CO2. Das Basismedium war entweder RPMI1640 + GlutaMAX (Gibco, Kat.-Nr. 61870), DMEM + Glucose + GlutaMAX (Gibco, Kat.-Nr. 10566024) oder McCoy's 5 A Medium (ATCC, Kat.-Nr. 302007). H929-Zellen wurden in mit 2-Mercaptoethanol (Sigma, Kat.-Nr. 97622) ergänzten Medien kultiviert. Zur Passage wurden adhärente Zelllinien wie vom Hersteller empfohlen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (Gibco, Kat.-Nr. 25200) behandelt. Die Zelllinien wurden von ATCC, DSMZ oder ECACC bezogen, mit Ausnahme der KMS-12-PE-Zellen, die im Rahmen einer Zusammenarbeit mit dem Parekh Lab am MSSM erhalten wurden. Alle Zelllinien wurden monatlich negativ auf Mykoplasmen getestet.

Die Arzneimittel wurden von MedChemExpress oder SelleckChem als lyophilisierte Pulver bezogen, in einem geeigneten Lösungsmittel rekonstituiert und als Einmal-Aliquots bei –80 °C für den Langzeitgebrauch gelagert. Für Massenreaktionstests wurden die Zellen mit 2 × 105 Zellen/ml dosiert und für die angegebene Dauer mit den ermittelten Arzneimittelkonzentrationen dosiert. Kontrollzellen wurden mit 0,25 % DMSO dosiert (Vehikelkontrolle). Die Zellen wurden dann in Standard-Polystyrolplatten mit 6 oder 12 Vertiefungen ausplattiert und für den angegebenen Zeitraum inkubiert. Bei Suspensionszelllinien wurden die Zellen zum Zeitpunkt der Messung vorsichtig resuspendiert, mit einem vollständigen Medium gespült, 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert und zur Messung in einem Medium resuspendiert. Bei anhaftenden Zelllinien wurde zum Zeitpunkt der Messung der Überstand jeder Vertiefung gesammelt, die Vertiefung mit PBS gespült und die Zellen unter Verwendung von 0,25 % Trypsin-EDTA (Gibco, Kat.-Nr. 25200) 7 Minuten lang abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden dann mit dem Überstand jeder Vertiefung kombiniert, 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert und zur Messung im Medium resuspendiert. Isolierte Primärzellen wurden in Lo-Bind-Platten mit 24 oder 96 Vertiefungen (Corning: Kat.-Nr. 3473) ausplattiert und nach der Inkubation wurden die Zellen vorsichtig resuspendiert, mit komplettem Medium gespült, 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert und in einer Kammer resuspendiert Medium zur Messung.

Primäre Krebsproben wurden von Patienten nach Einverständniserklärung und im Einklang mit den vom IRB genehmigten Protokollen entnommen (WCMC IRB # 0010004608, ISMMS IRB # STUDY-18-00456, CSHRI IRB # 1738582-3). Sobald die Primärprobe entnommen war, wurde der Versender über Nacht zur Verarbeitung zurück ins Travera-Labor geschickt. Alle FNA- und bösartigen Flüssigkeitsproben wurden in Transportbehältern mit einer Temperatur von 4 °C versandt (FedEx, Standardkühlgerät). Feinnadelaspirate wurden zur Konservierung während des Versands in HypoThermosol (BioLife Solutions) resuspendiert. Blut- und Knochenmarksproben wurden in klinische Probenröhrchen mit Natriumheparin und grünem Deckel (BD Vacutainer) gegeben und in Versandbehältern mit kontrollierter Raumtemperatur und Temperaturen zwischen 15 und 20 °C versandt (Inmark Life Sciences). Ansonsten wurde jeder Versender im Einklang mit den Vorschriften für eine Sendung biologischer Substanzen der Kategorie B vorbereitet.

Blut- und Knochenmarksproben wurden durch vorgeschaltete Filtration durch einen 70-µm-Maschenfilter (pluriSelect) und anschließende Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (Sigma Aldrich) verarbeitet. Anschließend wurden mononukleäre Zellpopulationen einer positiven Selektion mit magnetischen CD138+- oder CD33+-Mikrokügelchen (Miltenyi) unterzogen und unter Verwendung eines AutoMACS Pro Separators (Miltenyi) gemäß den Protokollen des Herstellers getrennt. Gereinigte Zellen wurden in RPMI-Medium, ergänzt mit Glutamax und 10 % FBS, resuspendiert. Feinnadelaspiratproben wurden zunächst einer Lyse roter Blutkörperchen (BD PharmLyse) unterzogen, gefolgt von einem mechanischen und enzymatischen Aufschluss unter Verwendung des Miltenyi-Kits zur Dissoziation humaner Tumore gemäß dem Protokoll des Herstellers. Anschließend wurden die Tumorzellen unter Verwendung des Miltenyi-Kits zur Isolierung menschlicher Tumorzellen gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Pleuraergussproben wurden ebenfalls zunächst einer Lyse roter Blutkörperchen unterzogen, gefolgt von einer MACS-basierten Tumorzellisolierung unter Verwendung desselben Miltenyi-Tumorzellisolierungskits. Sowohl für FNA- als auch für Ergussproben wurden angereicherte Tumorzellen in DMEM-Medium mit Glutamax und 20 % FBS resuspendiert.

Die Lebensfähigkeitsreaktion der Zellen wurde mit CellTitre-Glo 2.0 (Promega, Kat.-Nr. G9242) bewertet und die Lumineszenz wurde mit einem Plattenlesegerät quantifiziert. Die Zellen wurden in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden (Corning, Kat.-Nr. 3903) bei Anfangskonzentrationen von entweder 2 × 104 oder 2 × 105, je nach Zellverdopplungszeit, ausplattiert. Die medikamentöse Behandlung wurde zwischen 24 und 144 Stunden beurteilt. Alle Messungen wurden basierend auf dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Alle Durchflusszytometriemessungen wurden mit einem MACSQuant 10-Zytometer (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mit FlowJo (10.8.1) durchgeführt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Anfärben der Zellen mit Annexin V (Biolegend, CAT# 640945) und 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) (Biolegend, CAT# 422801) beurteilt. Lebende Zellen wurden als Zellen definiert, die negativ gefärbt waren sowohl DAPI als auch Annexin V. Um Durchflusszytometriedaten mit Massendaten zu vergleichen (Abb. 5 und ergänzende Abb. 9), wurden Teilmengen von 2500 Zellen 1000 Mal zufällig aus jedem Durchflusszytometriedatensatz entnommen, um ein 95% -Konfidenzintervall für die Lebensfähigkeit der Zellen zu definieren Auslesungen. Diese Messungen wurden dann mit der Kontrollbedingung verglichen, wobei eine Entscheidungsgrenze von 3 % (oben für Massenreaktionsmessungen beschrieben) verwendet wurde, um die p-Werte zu bestimmen. Um das Ausmaß der Reaktion zwischen Durchflusszytometrie und Massenanzeigen genau zu vergleichen, wurde der Y-Achsen-Grenzwert für Massenreaktionsmessungen bestimmt, indem die Massenreaktion zwischen Bildereignissen ermittelt wurde, die als „Zellen“ und „durchlässig“ klassifiziert wurden, innerhalb der Kontrollpopulation der gemessenen Zellen jedes Experiment als Proxy für einen 100%igen Lebensfähigkeitsverlust, bestimmt durch Durchflusszytometrie (ergänzende Abbildung 4).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Alle Quelldaten für die Abbildungen finden Sie in den Zusatzdaten 1.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04376-8

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Die Autoren möchten Scott Manalis und Keith Ligon für ihr Feedback und die hilfreichen Diskussionen danken. Diese Arbeit wurde durch die Phase I NCI SBIR 1R43CA228872-01A1 und die Phase II NSF SBIR 2026060 unterstützt. Die Zahlen wurden mit BioRender.com generiert.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Robert J. Kimmerling, Mark M. Stevens, Selim Olcum.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Anthony Minnah, Madeleine Vacha, Rachel LaBella.

Travera, Medford, MA, USA

Robert J. Kimmerling, Mark M. Stevens, Selim Olcum, Anthony Minnah, Madeleine Vacha, Rachel LaBella, Matthew Ferri, Steven C. Wasserman und Clifford A. Reid

Abteilung für klinische Forschung, Dignity Health, Sequoia Hospital, Redwood City, CA, USA

Juanita Fujii, Zayna Shaheen und Srividya Sundaresan

Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Drew Ribadeneyra, David S. Jayabalan, Ruben Niesvizky und Cara A. Rosenbaum

Abteilung für Medizin, Hämatologie und medizinische Onkologie, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Sarita Agte, Adolfo Aleman und Samir Parekh

Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Sarita Agte, Adolfo Aleman und Samir Parekh

Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Adolfo Aleman

Abteilung für Medizinische Onkologie, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA

Joseph A. Criscitiello und Marlise R. Luskin

Precision Immunology Institute, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Samir Parekh

Abteilung für Onkologische Wissenschaften, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Samir Parekh

Abteilung für vaskuläre und interventionelle Radiologie, Palo Alto Medical Foundation, Redwood City, CA, USA

Anobel Tamrazi

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RJK, MMS, SO, MV, AM, RL und CAR definierten die Forschungsstrategie und gestalteten die Experimente. RJK, AM, MV und RL führten Experimente durch. RJK, MMS, SO, AM, MV, RL und MF führten eine Datenanalyse durch. RJK, MMS, SO und SCW implementierten die Hardware und Software der Plattform. JF, ZS, SS, DR, DJ, SA, AA, JAC, RN, MRL, SP, CAR und AT verwalteten die Entnahme und den Versand klinischer Proben, einschließlich Patientenidentifizierung, Zustimmung des Patienten, Probenentnahme und Verpackung für den Versand sowie klinische Anmerkungen des Patienten . RJK, MMS und SO haben die Zahlen erstellt und das Manuskript geschrieben, mit Rückmeldungen aller Autoren.

Korrespondenz mit Robert J. Kimmerling oder Clifford A. Reid.

RJK, MMS, SO und CAR sind Gründer von Travera, das die SMR-Technologie für den klinischen Einsatz kommerzialisiert. RJK, MMS, SO, AM, MV, RL und CAR sind Mitarbeiter von Travera. MF, SW und AT erhalten Beratungshonorare von Travera. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Toril Holien und Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Kimmerling, RJ, Stevens, MM, Olcum, S. et al. Eine Pipeline für die malignitäts- und therapieunabhängige Beurteilung der Reaktion auf Krebsmedikamente mithilfe von Zellmassenmessungen. Commun Biol 5, 1295 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04270-3

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Eingegangen: 01. Juni 2022

Angenommen: 16. November 2022

Veröffentlicht: 26. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04270-3

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