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Mar 22, 2023

Magnetische Hydrogelpartikel verbessern die Nanoporensequenzierung von SARS

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 2163 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Hier wird ein Arbeitsablauf mit magnetischen Hydrogelpartikeln zur Erfassung und Konzentration von SARS-CoV-2 aus diagnostischen Restabstrichproben vorgestellt, der die Sequenzierungsergebnisse mithilfe der MinION-Sequenzierungsplattform von Oxford Nanopore Technologies erheblich verbessert. Unser Ansatz nutzt ein neuartiges, affinitätsbasiertes magnetisches Hydrogelpartikel, umgeht geringe Probenmengen und ermöglicht sowohl schnelle manuelle als auch automatisierte Arbeitsabläufe mit hohem Durchsatz, die mit der Nanopore-Sequenzierung kompatibel sind. Dieser Ansatz verbessert Standard-RNA-Extraktionsprotokolle, sorgt für eine bis zu 40-fache Verbesserung der Virus-Mapping-Reads und verbessert die Sequenzierungsabdeckung um 20–80 % bei diagnostischen Restproben mit niedrigerem Titer. Darüber hinaus zeigen wir, dass dieser Ansatz für künstlich hergestellte Influenzavirus- und Respiratory-Syncytial-Virus-Proben funktioniert, was darauf hindeutet, dass er zur Identifizierung und Verbesserung der Sequenzierungsergebnisse mehrerer Viren in VTM-Proben verwendet werden kann. Diese Methoden können manuell oder auf einer KingFisher-Automatisierungsplattform durchgeführt werden.

Bis zum 10. April 2022 gab es weltweit mehr als 500 Millionen COVID-19-Fälle und fast 6,2 Millionen COVID-19-bedingte Todesfälle1. Virusmutationen haben es der Pandemie ermöglicht, den Alltag zu durchdringen, obwohl weltweit weit verbreitete Gesundheitsmaßnahmen ergriffen wurden, um die Ausbreitung von SARS-CoV-2 zu verhindern. Die Erkennung und Überwachung neu auftretender Virusvarianten ist zu entscheidenden Instrumenten der globalen Gesundheitsreaktion geworden und unterstreicht die Notwendigkeit schnell einsetzbarer und genauer Sequenzierungsmethoden2,3,4,5. Jüngste Fortschritte bei Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS) haben den routinemäßigen Einsatz von Sequenzierung zur Überwachung und Identifizierung von Virusausbrüchen ermöglicht, aber viele NGS-Instrumente sind nicht tragbar und immer noch zu teuer, was ihre allgemeine Akzeptanz einschränkt6,7. Die MinION-Plattform von Oxford Nanopore Technologies (ONT) bietet eine relativ kostengünstige und tragbare Erkennungsstrategie, mit der verschiedene Atemwegsviren im Feld identifiziert und sequenziert werden können8,9,10.

Während Fortschritte bei der Sequenzierung eine schnelle Vor-Ort-Detektion und Charakterisierung von SARS-CoV-2 und anderen viralen Genomen möglich machen, sind diese tragbaren Sequenzierer immer noch durch bestimmte Nachteile eingeschränkt, nämlich, dass dort keine großen Mengen viraler RNA für die Sequenzierungsreaktionen verwendet werden kann es zu Genauigkeitsproblemen beim Basecalling kommen11,12,13,14,15,16. Diese technischen Einschränkungen verringern den Nutzen eines Tools, das die Fähigkeit verbessern könnte, schnell und genau auf Virusausbrüche zu reagieren und die Übertragung in Echtzeit zu verfolgen.

Die Erhöhung der Gesamtmenge an RNA-Material für die Analyse durch Probenanreicherung ist eine Strategie zur Verbesserung der Leistung von Sequenzierungsplattformen. Zu diesem Zweck versuchten wir, die Einschränkungen der Virussequenzierung eines Nanoporen-Sequenziergeräts zu beheben, indem wir die affinitätsbasierte magnetische Hydrogelpartikel-Anreicherungstechnologie (Nanotrap-Partikel) auf Proben des SARS-CoV-2-Virustransportmediums (VTM) anwendeten. Kurz gesagt verbessern magnetische Hydrogelpartikel die Testleistung, indem sie die schnelle Bindung von Analyten (z. B. intakten Virionen) aus großen Probenvolumina erleichtern und das Vorhandensein störender Substanzen in nachgeschalteten Tests reduzieren. Die Hydrogelpartikel fangen und konzentrieren die Analyten von Interesse mithilfe kleiner Moleküle wie Affinitätsfarbstoffen, die auf einem Gerüst aus vernetzten Polymerketten immobilisiert sind. Diese kleinen Moleküle binden oft mit sehr hoher Affinität an ihre Ziele (z. B. Virion-Oberflächenproteine) durch eine Kombination aus elektrostatischen und hydrophilen Wechselwirkungen. Sobald die Virionen an das magnetische Hydrogelpartikel gebunden sind, können sie mithilfe eines einfachen magnetischen Trennschritts konzentriert und aus der Probenmatrix entfernt werden. Nach der Konzentration sind die Virionen fest an den Affinitätsfarbstoff der Hydrogelpartikel gebunden und die viralen Nukleinsäuren stehen für die molekulare Analyse nicht zur Verfügung. Daher wird ein Nukleinsäure-Extraktionskit verwendet, um die Virionen zu lysieren und die viralen Nukleinsäuren als Vorbereitung für einen nachgeschalteten molekularen Test zu reinigen. Die Nanotrap-Partikeltechnologie hat in der klinischen Diagnostik breite Anwendung gefunden, indem sie Biomarker und Analyten in komplexen klinischen Proben anreichert und stabilisiert. Jüngste Studien haben diesen Konzentrations- und Extraktionsprozess nachgewiesen und gezeigt, dass die magnetischen Hydrogelpartikel in der Lage sind, viele Virustypen, einschließlich SARS-CoV-2, in mehreren molekularen Tests zu konzentrieren und den Nachweis zu verbessern17,18,19,20,21.

Bei Verwendung einer tragbaren Sequenzierungsplattform wie dem ONT MinION-Sequenziergerät sollte die Erhöhung der Menge an eingegebener RNA eine erfolgreiche Sequenzierung von Virusproben mit niedrigerem Titer ermöglichen, was wiederum möglicherweise den Anteil der Patientenproben erhöht, die für die Sequenzierung geeignet sind. Im Idealfall sollte dies die Identifizierung spezifischer Virusmutationen verbessern und die Reaktion auf neu auftretende problematische Varianten beschleunigen22,23,24.

Hier zeigen wir, dass magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) aktuelle Sequenzierungsabläufe verbessern und neue ermöglichen können, indem sie aktuelle Standard-RNA-Extraktionsmethoden verbessern. Wir zeigen, dass diese Arbeitsabläufe mit magnetischen Hydrogelpartikeln (Nanotrap-Partikeln) die Sequenzierungsergebnisse verbessern, indem sie die Gesamtzahl der viral kartierten Lesevorgänge erhöhen, was zu einer größeren Sequenzierungstiefe und -abdeckung führt. Nanotrap-Partikel-Workflows wurden für mehrere RNA-Extraktionskits entwickelt und ihre Nützlichkeit wird sowohl in künstlichen als auch in diagnostischen Restproben demonstriert.

Nanotrap Magnetic Virus Particles (SKU: 44.202) wurden von Ceres Nanosciences Inc. Manassas, VA, bereitgestellt.

Die künstlichen Proben bestanden aus hitzeinaktiviertem Virus, das in VTM (Puritan UniTranz-RT Transport Systems, Kat.-Nr. 89,233–458) versetzt war. Es wurden 5 Konzentrationen erzeugt (106, 105, 104, 103 und 102 TCID50/ml), beginnend mit einer reinen VTM-Probe, versetzt mit 106 TCID50/ml aus der Virusstammlösung, wurden vier 1:10-Reihenverdünnungen bis zu einer Konzentration von 102 durchgeführt TCID50/ml unter Verwendung von reinem VTM als Verdünnungspuffer. Die Ausgangskonzentration des Virusstamms basierte auf der vom Hersteller angegebenen Konzentration. Hitzeinaktivierte Viren wurden von ZeptoMetrix erworben: SARS-CoV-2 (Kat.-Nr. 0810587CFHI), Influenza A-H1N1 (Kat.-Nr. 0810109CFHI) und Respiratory Syncytial Virus Type A (RSV) (Kat.-Nr. 0810040ACFHI).

SARS-CoV-2-positive diagnostische Restproben im Virustransportmedium wurden von Discovery Life Sciences, Huntsville, AL, erworben. Discovery Life Sciences hat diese Proben zuvor mittels RT-PCR getestet und dabei Zyklenschwellenwerte im Bereich von 24 bis 35 erhalten. Von Discovery Life Sciences erworbene Proben folgen dem „Bioproben-Kaufvertrag“ und werden mit der folgenden Datengenerierung gemäß ihren Identifizierungsrichtlinien deidentifiziert. Dies ermöglicht die Verwendung solcher Proben für Forschung und Veröffentlichung, einschließlich qPCR und Sequenzierung.

Nanotrap-Partikel-Workflow 1 (manuelle magnetische Hydrogel-Partikel-Methode mit säulenbasiertem RNA-Extraktionskit): Zweihundert Mikroliter magnetische Hydrogel-Partikel (Nanotrap-Partikel) in einer Konzentration von 5 mg/ml wurden zu 1000 µL VTM-Proben hinzugefügt. Die Menge der verwendeten Nanotrap-Partikel basierte auf früheren Experimenten zur Optimierung der Viruseinfangung17,18,19,20,21. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann 2 Minuten lang auf einen Magnetabscheider gelegt, damit die Nanotrap-Partikel pelletieren konnten. Überstände wurden entfernt und verworfen. Dem Nanotrap-Partikelpellet wurden einhundert Mikroliter RNAse/DNase-freies Wasser mit 350 µL QIAGEN Buffer RLT zugesetzt. Die Proben wurden 10 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie 2 Minuten lang auf einen Magnetabscheider gelegt wurden, damit die Nanotrap-Partikel pelletieren konnten. Überstände, die das virale Nukleinsäurematerial enthielten, wurden für die RNA-Extraktion mit dem QIAGEN RNeasy MinElute Cleanup Kit (Kat.-Nr. 74,204) gemäß den 100-µL-Arbeitsablaufanweisungen des Herstellers verarbeitet. Nach der RNA-Extraktion waren die RNA-Proben für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek bereit.

Nanotrap-Partikel-Workflow 2 (manuelle magnetische Hydrogel-Partikelmethode mit magnetischem Bead-basiertem RNA-Extraktionskit): Dreihundert Mikroliter PBS mit 0,05 % Tween-20 (v/v) wurden direkt zu 500 µL VTM-Proben gegeben. Zu jeder VTM-Probe wurden zweihundert Mikroliter magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) hinzugefügt, die dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Menge der für diese Experimente verwendeten Nanotrap-Partikel basierte auf früheren erfolgreichen Arbeitsabläufen zur Virenerfassung und wurde im Hinblick auf Leistung und Kosten optimiert17,18,19,20,21. Die Proben wurden 2 Minuten lang auf einen Magnetabscheider gelegt, damit die Nanotrap-Partikel pelletieren konnten. Überstände wurden entfernt und verworfen. Nanofallen-Partikelpellets wurden in 1 ml molekularem Wasser mit 0,05 % Tween-20 (v/v) resuspendiert. Nach einer kurzen Resuspension wurden die Proben erneut für 2 Minuten auf einen Magnetabscheider gelegt, damit die Nanotrap-Partikel pelletieren konnten, und der Überstand wurde entfernt und verworfen. Nanofallenpartikel wurden in 200 µL MagMAX-Mikrobiom-Lyselösung resuspendiert und die Proben 10 Minuten lang bei 65 °C auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf einen Magnetabscheider gelegt, damit die Nanotrap-Partikel 2 Minuten lang pelletieren konnten. Überstände, die das virale Nukleinsäurematerial enthielten, wurden einer RNA-Extraktion mit dem MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (Kat.-Nr. A42357) gemäß den 200-µL-Workflow-Anweisungen des Herstellers unterzogen. Nach der Verarbeitung des Extraktionskits waren die RNA-Proben für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek bereit.

Nanotrap-Partikel-Workflow 3 (Automatisierte magnetische Hydrogel-Partikelmethode mit magnetischem Bead-basiertem RNA-Extraktionskit): Bei der folgenden Methode wurden die KingFisher-Automatisierungsplattform (KingFisher Apex) und zugehörige Verbrauchsmaterialien verwendet. Dreihundert Mikroliter PBS mit 0,05 % Tween-20 (V/V) wurden direkt zu 500 µL VTM-Proben in einer KingFisher-Platte mit 96 tiefen Vertiefungen gegeben. Zu jeder VTM-Probe wurden zweihundert Mikroliter magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) hinzugefügt. Die Menge der für diese Experimente verwendeten Nanotrap-Partikel basierte auf früheren erfolgreichen Arbeitsabläufen zur Virenerfassung und wurde im Hinblick auf Leistung und Kosten optimiert17,18,19,20,21. Wasser in Molekularqualität mit 0,05 % Tween-20 (v/v) wurde zu einer zweiten 96-DW-Platte gegeben, und 200 µL MagMAX-Mikrobiom-Lyselösung wurden zu einer dritten 96-DW-Platte hinzugefügt. Zur Verarbeitung der Nanotrap-Partikel mithilfe der drei vorbereiteten 96-DW-Platten wurde ein benutzerdefiniertes KingFisher-Programm „NT2MM.kfx“ erstellt. Der gesamte Prozess dauerte 30 Minuten und das endgültige Eluat enthielt extrahierte virale RNA.

Nach der Verarbeitung magnetischer Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel), ähnlich dem „Nanotrap Particle Workflow 2“, wurden extrahierte virale RNA-Proben mit dem MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit gemäß den 200-µL-Workflow-Anweisungen des Herstellers verarbeitet. Für diesen Workflow wurde die Extraktion auf der KingFisher-Automatisierungsplattform automatisiert. Die Autoren gehen davon aus, dass Nanotrap Particle Workflow 2 und 3 funktionell gleich sind und dieselben Reagenzien und Extraktionsbedingungen verwenden. Der einzige nennenswerte Unterschied besteht darin, dass „Nanotrap Particle Workflow 3“ auf der KingFisher-Automatisierungsplattform durchgeführt wird. Nach der Verarbeitung des Extraktionskits waren die RNA-Proben für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek bereit.

Die oben beschriebenen Arbeitsabläufe mit magnetischen Hydrogelpartikeln (Nanotrap-Partikeln) wurden mit zwei Standard-Extraktionskit-Arbeitsabläufen ohne Nanotrap-Partikel verglichen. Zum Vergleich von Arbeitsablauf 1 wurden die Proben mit dem QIAGEN RNeasy MinElute Cleanup Kit (Kat.-Nr. 74.204) gemäß den Anweisungen des Herstellers für den 100-µL-Arbeitsablauf verarbeitet. Für den Vergleich von Arbeitsablauf 2 und 3 wurden die Proben mit dem ThermoFisher MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (Kat.-Nr. A42357) gemäß den 200-µL-Arbeitsablaufanweisungen des Herstellers verarbeitet.

Die Methode mit magnetischen Hydrogelpartikeln (Nanotrap-Partikel) ermöglicht es einem Benutzer, im Vergleich zu anderen Extraktionsmethoden ein größeres Probeneingabevolumen abzufragen. Für den Nanotrap Particle Workflow 1 beträgt der theoretische Anreicherungsfaktor 10 ×, da unsere Methode 1000 µL VTM relativ zum 100 µL Eingabevolumen der Empfehlungen des Säulenherstellers verarbeitet. Beachten Sie, dass wir angesichts der begrenzten Volumina der klinischen VTM-Sammlungen die für den Nanotrap Workflow verwendeten Volumina von 1 µL auf 1000 µL beschränkt haben.

Für den Nanotrap-Partikel-Workflow 2 und 3 beträgt der theoretische Anreicherungsfaktor 2,5 ×, da unsere Methode 500 µL VTM relativ zum 200 µL Eingabevolumen der Empfehlungen des Silica-Bead-Herstellers verarbeitet. Um die Automatisierung zu ermöglichen, haben wir die für Workflow 2 und 3 verwendeten Volumes eingeschränkt und so die Kompatibilität mit der KingFisher-Automatisierungsplattform sichergestellt.

Für die RT-PCR-Analyse von SARS-CoV-2-Proben wurde das IDT 2019 nCoV CDC EUA Kit (Kat.-Nr. 1.006.770), das N1-Primer/Sonden enthält, für die Echtzeit-RT-PCR verwendet. Gemäß der Empfehlung von IDT wurde TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix von ThermoFisher (Kat.-Nr. A15300) im IDT 2019 nCoV CDC EUA-Assay verwendet. Für jede PCR-Reaktion wurden 8,5 µL nukleasefreies Wasser, 5 µL der TaqPath-Lösung, 1,5 µL des N1-Primers/der N1-Sonde und 5 µL RNA-Matrize verwendet. Die PCR-Bedingungen wurden gemäß den Anweisungen von IDT auf einem Roche LightCycler 96 durchgeführt. Alle SARS-CoV-2-Experimente (sowohl hitzeinaktivierte als auch diagnostische Restexperimente) verwendeten diesen Assay.

Für die RT-PCR-Analyse von Influenza A- und RSV-Proben wurden das Primerdesign Influenza A H1 Kit (Path-H1N1-v2.0-Standard) und das Primerdesign RSV Kit (Path-RSV-A-Standard) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die PCR-Bedingungen wurden gemäß den Anweisungen von Primerdesign auf einem Roche LightCycler 96 durchgeführt.

Nach der viralen RNA-Extraktion wurden die Proben für die Sequenzierung mithilfe des entwickelten ARTIC-Netzwerks vorbereitet; „nCoV-2019 Sequencing Protocol v3 (Niedrige Kosten)“25. Kurz gesagt, amplifizierte cDNA wurde unter Verwendung eines gezielten Amplikon-Ansatzes hergestellt. Gemäß dem ARTIC nCov-2019-Protokoll wurden IDT ARTIC V3 Amplicon Sequencing Panel-Primer verwendet. Diese 218 Primer, die das gesamte SARS-CoV-2-Genom abdecken, wurden zur Erzeugung und Amplifikation von cDNA aus der extrahierten viralen RNA verwendet. Sobald die cDNA vorbereitet war, wurden die Proben mit dem Ligation Sequencing Kit von Oxford Nanopore Technologies (ONT) verarbeitet und mit dem ONT Native Barcoding Expansion Kit einzeln mit Barcodes versehen. Native Barcodes wurden mit einem modifizierten „One-Pot“-Protokoll nach dem „nCov-2019 Sequencing Protocol v3“ erstellt (Niedrige Kosten)“-Anweisungen. Diese einzelnen Proben wurden gepoolt und mit AMPure XP-Magnetkügelchen (Kat.-Nr. A63880) konzentriert. Die gepoolte Bibliothek wurde auf eine ONT FLO-MIN106 R.9-Fließzelle geladen, die mit der ONT Mk1C-Sequenzierungsplattform verwendet wurde. Sofern nicht anders angegeben, wurde der ONT Mk1C 24 Stunden lang mit dem LSK109-Kit und ausgewählten EXP-ND-196-Barcodes betrieben.

Zur Analyse und Verarbeitung der von der ONT Mk1C-Plattform generierten Sequenzierungsdaten wurden die folgenden Tools verwendet: Live-Basecalling und Demultiplexing wurden mit der in das ONT Mk1C MinION-Gerät integrierten ONT MinKnow-Software durchgeführt; Die allgemeine Klassifizierung und viral kartierte Lesevorgänge wurden mithilfe des WIMP-Protokolls vom 09.03.2020 über das Epi2me-Webtool von ONT generiert. Eine weitere Abdeckungsanalyse wurde mit Minimap2 und Samtools über das Webportal UseGalaxy.org durchgeführt. Gepaarte t-Tests wurden durchgeführt und Zahlen wurden mit Graphpad Prism 9 generiert. Die Nextclade- und Pangolin-Analyse wurde über den von EPI2ME Labs entwickelten ARTIC SARS-CoV-2 Workflow26 durchgeführt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) mehrere respiratorische Viruspathogene einfangen und konzentrieren, darunter SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und RSV17,18,19,20,21. Diese Anreicherung führte zu verbesserten Ergebnissen verschiedener molekularer Tests, einschließlich Echtzeit-RT-PCR. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Nanotrap-Partikel, wenn sie diese molekularen Tests verbessern könnten, auch die Sequenzierungsplattformen verbessern könnten, indem sie die Menge der für die Sequenzierung verfügbaren viralen RNA erhöhen. Um die Robustheit und Benutzerfreundlichkeit der Nanotrap-Partikeltechnologie bei der Sequenzierung zu demonstrieren, wurden drei Arbeitsabläufe entwickelt: eine manuelle Methode mit einem säulenbasierten RNA-Extraktionskit, eine manuelle Methode mit einem auf Magnetkügelchen basierenden RNA-Extraktionskit und eine automatisierte Methode mit einem auf Magnetkügelchen basierenden RNA-Extraktionskit.

Wir haben eine Methode entwickelt, die magnetisches Hydrogel (Nanotrap-Partikel) nutzt, um ganze SARS-CoV-2-Virionen einzufangen und zu konzentrieren, gefolgt von einer säulenbasierten RNA-Extraktion, und dabei die Fähigkeit der Nanotrap-Partikel untersucht, die Nanoporensequenzierung von SARS-CoV-2 zu verbessern. Zu diesem Zweck wurden künstliche VTM-Proben von hitzeinaktiviertem SARS-CoV-2 mit Nanotrap Particle Workflow 1 unter Verwendung des QIAGEN RNeasy MinElute Cleanup Kit für die virale RNA-Extraktion ([+ NT]) oder ohne Nanotrap-Partikel unter Verwendung des Rneasy-Kits allein verarbeitet ([− NT]). Die extrahierten RNA-Proben wurden für die Sequenzierung unter Verwendung des ARTIC nCoV-2019-Sequenzierungsprotokolls vorbereitet und auf dem ONT Mk1C-Sequenzierer ausgeführt, wie im Abschnitt „Methode“ beschrieben. Extrahierte virale RNA wurde auch mit dem IDT 2019 nCoV CDC EUA RT-PCR Kit analysiert, um eine mögliche Korrelation zwischen den beiden Tests zu identifizieren und das Vorhandensein von SARS-Cov-2 zu bestätigen. Wie in Abb. 1A gezeigt, verbesserten Nanotrap-Partikel die Sequenzierungsergebnisse bei mehreren Konzentrationen im Vergleich zum Arbeitsablauf ohne Nanotrap-Partikel. Bei 106 TCID50/ml wurde eine 6,0-fache Verbesserung der SARS-CoV-2-Viruskartierungswerte und bei 105 TCID50/ml eine 2,0-fache Verbesserung beobachtet. Die statistische Analyse zeigte, dass die Verbesserungen mit p-Werten von < 0,05 für beide Viruskonzentrationen signifikant waren. Unter 105 TCID50/ml wurde zwischen den Proben [+ NT] und [− NT] keine signifikante Verbesserung festgestellt. Bei der Durchführung einer RT-PCR verbesserten Nanotrap-Partikel die Viruswiederherstellung um 2 PCR-Zyklus-Schwellenwerte (Cts) in den ersten vier Verdünnungsreihen (Abb. 1B). Gepaarte T-Tests bestätigten eine signifikante Verbesserung für dieselben vier Konzentrationen.

Magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel-Workflow 1) verbessern die Sequenzierung künstlicher SARS-CoV-2-Proben. Hitzeinaktiviertes SARS-CoV-2 wurde in VTM mit 102, 103, 104, 105 und 106 TCID50/ml versetzt und die Proben wurden mit Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] oder dem Rneasy Kit allein [− NT] verarbeitet; n = 3 für jeden Prozess. Anschließend wurden die Proben einer Sequenzierung auf einer ONT MinION R.9-Durchflusszelle (a) oder einer RT-PCR (b) unterzogen. [+ NT] wurden mit [− NT] mittels gepaartem t-Test verglichen, um die Signifikanz einer erhöhten Viruserkennung zu beurteilen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Säulen-RNA-Extraktionen werden typischerweise in Labortischumgebungen mit geringem Probendurchsatz und hoher Komplexität eingesetzt. Angesichts dieser Einschränkungen haben wir die Fähigkeit der magnetischen Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) bewertet, eine RNA-Extraktionsmethode auf Basis magnetischer Perlen zu verbessern. Der Nanotrap-Partikel-Workflow 2 wurde auf ähnliche Weise wie Workflow 1 getestet: künstlich hergestellte VTM-Proben mit SARS-CoV-2 wurden mit ([+ NT]) oder ohne ([− NT]) Nanotrap-Partikel verarbeitet. Die [− NT]-Probe wurde allein mit dem MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit verarbeitet. Nach der RNA-Extraktion wurden die Proben für die Sequenzierung mithilfe des ARTIC nCoV-2019-Sequenzierungsprotokolls vorbereitet, das auf der ONT Mk1C-Sequenzierungsplattform ausgeführt wurde. Verarbeitete RNA-Proben wurden auch mittels RT-PCR mit dem IDT 2019 nCoV CDC EUA RT-PCR Kit analysiert, um das Vorhandensein von Viren zu bestätigen.

Nanofallenpartikel verbesserten die Sequenzierungsergebnisse bei mehreren Konzentrationen im Vergleich zum [− NT]-Arbeitsablauf (Abb. 2A). Bei 106 TCID50/ml wurde eine 1,9-fache Verbesserung der SARS-CoV-2-Viruskartierungswerte und bei 105 TCID50/ml eine 1,4-fache Verbesserung beobachtet. Die statistische Analyse bestätigte die Signifikanz, wobei für beide Ergebnisse p-Werte von < 0,05 berechnet wurden. Darüber hinaus verbesserten Nanotrap-Partikel den SARS-CoV-2-Nachweis in der RT-PCR und führten zu einer durchschnittlichen Verbesserung um 1,5 Ct bei Virustitern über 102 TCID50/ml (Abb. 2B).

Magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap Particle Workflow 2) verbessern die Sequenzierung künstlich hergestellter SARS-CoV-2-Proben. Hitzeinaktiviertes SARS-CoV-2 wurde in VTM mit 102, 103, 104, 105 und 106 TCID50/ml versetzt und die Proben wurden mit Nanotrap Particle Workflow 2 [+ NT] oder dem MagMAX Kit allein [− NT] verarbeitet; n = 3 für jeden Prozess. Anschließend wurden die Proben einer Sequenzierung auf einer ONT MinION R.9-Durchflusszelle (a) oder einer RT-PCR (b) unterzogen. [+ NT] wurden mit [− NT] mittels gepaartem t-Test verglichen, um die Signifikanz einer erhöhten Viruserkennung zu beurteilen. *p < 0,05, **p < 0,01.

Künstliche VTM-Proben sind nützlich für die Bewertung von Methoden in einer unberührten Umgebung, sie geben jedoch nicht unbedingt Aufschluss darüber, wie eine Methode mit klinischen Proben funktioniert. Daher haben wir die Arbeitsabläufe mit magnetischen Hydrogelpartikeln (Nanotrap-Partikeln) anhand diagnostischer klinischer VTM-Abstrichproben bewertet. Wir verwendeten zehn diagnostische VTM-Restproben mit gemeldeten Schwellenwerten für den RT-PCR-Testzyklus zwischen 24 und 35 (wie vom Probenlieferanten angegeben). Für diese diagnostischen Restproben wurde der gleiche Verarbeitungs- und Sequenzierungsablauf wie bei künstlichen Proben angewendet. Um die Auswirkung des Nanotrap-Partikel-Workflows auf die Sequenzierungsergebnisse besser beurteilen zu können, haben wir sowohl die gesamten viral kartierten Lesevorgänge als auch die damit verbundene prozentuale Genomabdeckung in 30-facher Tiefe der verarbeiteten Proben quantifiziert. Die Ergebnisse in Abb. 3A, die mit dem Nanotrap Particle Workflow 1[+ NT] erstellt wurden, zeigen, dass Nanotrap-Partikel die Sequenzierungsergebnisse von 100 % der diagnostischen Restproben (n = 10) verbesserten. Im Vergleich zum Arbeitsablauf ohne Nanotrap-Partikel[− NT] führte die Verwendung des Nanotrap-Partikel-Workflows 1 zu einer durchschnittlichen 7-fachen Verbesserung der gesamten viral kartierten Messwerte über alle diagnostischen Restproben hinweg. Diese Verbesserungen der viralen Kartierung führten zu einer durchschnittlichen Steigerung der viralen Genomabdeckung um 52 % gegenüber Proben, die ohne Nanotrap-Partikel verarbeitet wurden (Abb. 3B). Ein gepaarter t-Test über alle 10 Proben zeigt, dass die Steigerungen sowohl für die viralen kartierten Lesevorgänge als auch für den Abdeckungsprozentsatz statistisch signifikant sind (Abb. 3D, Abb. 3E). In Abb. 3C bestätigte die RT-PCR das Vorhandensein von SARS-CoV-2 für alle 10 Proben, was ebenfalls zu einer durchschnittlichen Verbesserung von 4 Ct gegenüber [− NT]-Proben führte. Es ist erwähnenswert, dass 3 Proben unter der Nachweisgrenze des RT-PCR-Assays lagen, wenn sie ohne Nanotrap-Partikel verarbeitet wurden, aber alle 10 Proben nachweisbare RNA aufwiesen, als die Nanotrap-Partikel bei der Probenverarbeitung verwendet wurden.

Magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap Particle Workflow 1) verbessern die Sequenzierung diagnostischer SARS-CoV-2-Restproben. 10 SARS-CoV-2-positive diagnostische Restproben wurden mit dem Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] oder dem RNEasy Kit allein [− NT] verarbeitet. Anschließend wurden die Proben auf einer ONT MinION R.9-Durchflusszelle sequenziert und mittels Viral Mapped Reads auf SARS-CoV-2 (a), Viral Genome Coverage at 30 × Depth (b) oder RT-PCR (c) analysiert. [+ NT] wurden mit [− NT] mittels gepaartem t-Test verglichen, um die Signifikanz eines erhöhten Virusnachweises zu beurteilen (d),(e). ***p < 0,001.

Einer der Vorteile der magnetpartikelbasierten Probenverarbeitung besteht darin, dass die Methode leicht automatisiert werden kann. Zu diesem Zweck haben wir eine automatisierte Version des magnetischen Hydrogelpartikel-Workflows (Nanotrap Particle Workflow 3) entwickelt, der auf der KingFisher-Automatisierungsplattform verwendet werden soll. Diese Methode ist funktionell mit dem Nanotrap Particle Workflow 2 identisch, verwendet dieselben Reagenzien und Extraktionsschritte und profitiert von denselben Leistungsmerkmalen. Wir verglichen diese automatisierte Nanotrap Particle Workflow 3-Methode ([+ NT]) mit einer Methode ohne Nanotrap-Partikel unter Verwendung von zehn zusätzlichen SARS-CoV-2-positiven diagnostischen Restproben ([− NT]) und untersuchten erneut die Sequenzierung und den RT-PCR-Ergebnis der beiden Methoden. Wir beobachteten, dass die Nanotrap-Partikelverarbeitung die Sequenzierungsergebnisse für 7 von 10 Proben deutlich verbesserte, was zu einer durchschnittlichen Verbesserung um das 42-fache der gesamten viral kartierten Lesevorgänge führte (Abb. 4A). Dies entsprach einem durchschnittlichen Anstieg der viralen Genomabdeckung um 51 % im Vergleich zu [− NT]-Proben (Abb. 4B). Gepaarte t-Tests bestätigten, dass Nanotrap-Partikel sowohl die viralen kartierten Lesevorgänge (Abb. 4D) als auch die Genomabdeckung (Abb. 4E) signifikant verbesserten. Wie beim vorherigen Satz diagnostischer Restproben bestätigte die RT-PCR das Vorhandensein von SARS-CoV-2 für alle 10 Proben. Der [+ NT] automatisierte Prozess verbesserte auch die RT-PCR-Ergebnisse, was zu einer durchschnittlichen Verbesserung von 3,7 Ct führte, wie in Abb. 4C dargestellt.

Magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap Particle Workflow 3) verbessern die Sequenzierung diagnostischer SARS-CoV-2-Restproben. 10 SARS-CoV-2-positive diagnostische Restproben wurden mit Nanotrap Particle Workflow 3 [+ NT] oder dem MagMAX-Kit allein [− NT] verarbeitet. Anschließend wurden die Proben auf einer ONT MinION R.9-Durchflusszelle sequenziert und mittels Viral Mapped Reads auf SARS-CoV-2 (a), Viral Genome Coverage at 30 × Depth (b) oder RT-PCR (c) analysiert. [+ NT] wurden mit [− NT] mittels gepaartem t-Test verglichen, um die Signifikanz eines erhöhten Virusnachweises zu beurteilen (d), (e). *p < 0,05, **p < 0,01.

Nach der Verarbeitung und Sequenzierung von zehn SARS-CoV-2-positiven diagnostischen Restproben mit Nanotrap Particle Workflow 3 haben wir weiter untersucht, wie sich die Verbesserung der viralen Kartierungswerte und der prozentualen Genomabdeckung auf die nachgelagerte SARS-CoV-2-Analyse auswirken würde. Insbesondere haben wir das Bioinformatik-Tool „ARTIC SARS-CoV-2 Workflow“ des EPI2ME-Labors verwendet, um Pangolin- und Nextclade-Analysen durchzuführen und die potenzielle Verbesserung durch die Anreicherung magnetischer Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) weiter zu charakterisieren. Dabei handelt es sich um weit verbreitete SARS-CoV-2-Bioinformatik-Abstammungstools zur Verfolgung und Analyse von SARS-CoV-2-Varianten, die leicht verständliche qualitative Metriken zur Charakterisierung und zum Vergleich von Sequenzierungsdaten liefern. Kurz zusammengefasst handelt es sich bei Pangolin um eine SARS-CoV-2-Abstammungszuweisungspipeline, die mit der Ausrichtung einer Eingabesequenz an der ursprünglichen Wildtyp-Wuhan-Sequenz beginnt. Das Tool vergleicht dann alle in den ausgerichteten Kodierungsregionen erkannten Änderungen mit einer Datenbank bekannter Varianten, um einen Abstammungsbericht zu erstellen, der die nächstgelegene bekannte Variante ausgibt. Schließlich wird ein „Mehrdeutigkeitswert“ generiert, der die Wahrscheinlichkeit angibt, dass der Abstammungsbericht korrekt ist. Im Bereich von 0–1 gilt: Je niedriger die Punktzahl, desto geringer ist die „Mehrdeutigkeit“, was einem höheren Vertrauensniveau entspricht, dass die Analyse korrekt ist. Ähnlich wie Pangolin ist Nextclade ein mehrstufiges Alignment-Tool, das eine Eingabesequenz mit der Wuhan-Sequenz vergleicht und Mutationen identifiziert, die am besten zu zuvor erkannten Varianten passen. Das Ergebnis sind: ein Abstammungsbericht, die Anzahl der Mutationen, eine Alignment-Karte, die die Genomabdeckung angibt, und ein allgemeiner Überblick QC-Metrik der analysierten Daten. Wir haben Pangolin verwendet, um einen Abstammungsbericht und einen Mehrdeutigkeitsscore für sowohl [+ NT] als auch [− NT] verarbeitete Proben zu erstellen. Für [− NT]-Proben konnte Pangolin nur für 3 von 10 Proben einen Abstammungsbericht mit einem durchschnittlichen Mehrdeutigkeitswert von 0,824 erstellen. In Gegenwart von Nanotrap-Partikeln [+ NT] war Pangolin jedoch in der Lage, alle 10 Proben zu charakterisieren, was einen durchschnittlichen Mehrdeutigkeitswert von 0,898 ergab, was darauf hindeutet, dass Nanotrap-Partikel die Fähigkeit der Software zur Charakterisierung von Proben verbessern konnten (Abb. 5A).

Magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) verbessern bioinformatische Werkzeuge bei der Analyse von SARS-CoV-2-Proben. 10 SARS-CoV-2-positive diagnostische Restproben wurden mit Nanotrap Particle Workflow 3 [+ NT] oder dem MagMAX-Kit allein [− NT] verarbeitet. Die Proben wurden auf einer ONT MinION R.9-Durchflusszelle sequenziert und von Pangolin (a) und Nextclade analysiert. Dabei wurden Folgendes bewertet: QC-Score-Vergleich aller 10 Proben (b), Gesamtzahl der Genompositionen konnte pro Probe nicht charakterisiert werden (fehlende n). , weniger = besser) (c), Gesamtzahl der pro Probe nachgewiesenen Mutationen (d).

Die Nextclade-Analyse zeigte einen ähnlichen Trend bei der Verwendung von Nanotrap-Partikeln, wodurch mehr Proben mit einer höheren Qualitätsbewertung charakterisiert werden konnten. Nextclade verwendet ein dreistufiges QC-System: „Gut“, „Mittelmäßig“ und „Schlecht“. Die QC-Stufe gibt an, wie viele der bereitgestellten Daten von Nextclade charakterisiert werden konnten, um das virale Genom genau zu beurteilen und eine genaue Klassifizierung zu ermitteln. Wenn die Stichprobe nicht genügend Daten für die Zuweisung einer Klassifizierung liefert, erhalten die Stichproben „Keine Bewertung“. Hier wurden zehn von zehn mit Nanotrap-Partikeln verarbeiteten Proben charakterisiert, wobei 6 von 10 Proben die QC-Bewertung „gut“ und 4 von 10 Proben die QC-Bewertung „schlecht“ erhielten. Bei [− NT]-Proben erhielten 2 von 10 Proben die QC-Bewertung „mittelmäßig“ und 6 von 10 Proben erhielten die QC-Bewertung „schlecht“. Die verbleibenden zwei Proben konnten nicht charakterisiert werden und erhielten keine Bewertung, was darauf hindeutet, dass Nanotrap-Partikel die Fähigkeit der Software zur Charakterisierung von Proben verbesserten, sodass zuvor „schlechte“ oder „mittelmäßige“ Proben zu „guten“ Proben wurden (Abb. 5B). Darüber hinaus verbesserte die Nanotrap-Partikelverarbeitung die Nextclade-Analyse, indem die Menge der fehlenden Basen um durchschnittlich 15.556 „n“s verringert wurde, oder die Anzahl der viralen Genompositionen, die von Nextclade nicht charakterisiert werden konnten (Abb. 5C). Bei den „fehlenden n“ handelt es sich um blinde Flecken im viralen Genom, anhand derer nicht festgestellt werden kann, ob an dieser Stelle eine Mutation vorliegt. Diese „fehlenden n“ tragen auch zur Nextclade-Qualitätsbewertung bei. Je weniger „n“ fehlen, desto genauer und nützlicher wird das Nextclade-Tool, das die Analyse eines größeren Teils des SARS-CoV-2-Genoms ermöglicht. Bei mit Nanotrap-Partikeln verarbeiteten Proben erkannte Nextclade durchschnittlich 9,2 Mutationen mehr pro Probe im Vergleich zu Proben, die ohne Nanotrap-Partikel verarbeitet wurden (Abb. 5D). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse weiter, dass die virale Anreicherung von Nanotrap-Partikeln eine bessere Analyse von Proben mit gängigen Bioinformatik-Tools ermöglicht.

Im Idealfall sollten Technologien zur Viruskonzentration die Konzentration mehrerer Viren ermöglichen, nicht nur SARS-CoV-2. Wie frühere Studien gezeigt haben, fangen magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) eine Vielzahl von Atemwegsviren ein; Wir haben kurz untersucht, ob die Nanotrap-Partikel auch zur Verbesserung der Sequenzierung von Influenza A (H1N1) und Respiratory Syncytial Virus (RSV)18,19,20 verwendet werden könnten. Reines VTM wurde separat mit 106 TCID50/ml entweder mit inaktiviertem Influenza A oder RSV versetzt. Unter Verwendung des zuvor etablierten säulenbasierten RNA-Extraktionsprotokolls wurden virale künstliche Proben mit Nanotrap Particle Workflow 1[+ NT] verarbeitet und die Ergebnisse mit Proben verglichen, die ohne Nanotrap-Partikel[− NT] verarbeitet wurden. Die resultierenden RNA-Eluate wurden dann unter Verwendung einer modifizierten Version des ARTIC Library Prep-Protokolls unter Verwendung von für Influenza A und RSV spezifischen Primern für die Sequenzierung vorbereitet. Die Proben wurden auf dem ONT Mk1C ausgeführt. Die Ergebnisse in Abb. 6A und Abb. 6C zeigen, dass Nanotrap-Partikel die Nanoporen-Sequenzierungsergebnisse für künstliche Influenza-A- bzw. RSV-Proben verbessern. Nanotrap-Partikel verbesserten die viralen Kartierungswerte sowohl für Influenza A als auch für RSV um das Vierfache im Vergleich zu Proben, die ohne Nanotrap-Partikel verarbeitet wurden. Darüber hinaus verbesserte der Einsatz von Nanotrap-Partikeln bei der Probenverarbeitung den Nachweis viraler RNA, gemessen mittels RT-PCR für Influenza A bzw. RSV (Abb. 6B, Abb. 6D). Der gepaarte t-Test bestätigte, dass die durch Nanotrap-Partikel verursachte Verbesserung mit berechneten p-Werten < 0,05 statistisch signifikant war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nanotrap-Partikel zur Identifizierung und Verbesserung der Sequenzierungsergebnisse mehrerer Viren in VTM-Proben verwendet werden können.

Magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) verbessern die Sequenzierung mehrerer Atemwegsviren. Hitzeinaktiviertes Influenza A (H1N1) (a, b) oder RSV (c, d) wurde mit 106 TCID50/ml in VTM gegeben und die Proben wurden mit Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] oder dem Qiagen RNEasy Kit allein [−] verarbeitet NT]; n = 3 für beide Prozesse. Anschließend wurden die Proben auf einer ONT MinION R.9-Durchflusszelle oder RT-PCR sequenziert. [+ NT] wurden mit [− NT] mittels gepaartem t-Test verglichen, um die Signifikanz einer erhöhten Viruserkennung zu beurteilen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Jüngste Fortschritte bei Next-Generation-Sequenzierungs- und Post-Processing-Amplifikationstechniken haben die Virustiter gesenkt, die für erfolgreiche Sequenzierungsläufe und eine genaue Mutationserkennung erforderlich sind27,28. Während diese Fortschritte im Allgemeinen die Empfindlichkeit von Sequenzierungsanwendungen verbessert haben, gibt es bei bestimmten Sequenzierungsplattformen immer noch einen erheblichen Teil der klinisch relevanten Virusproben, die aufgrund niedriger Virustiter nicht sequenziert werden können, Proben, in denen nicht genügend Nukleinsäuremoleküle für die Bioinformatik-Tools vorhanden sind decken das gesamte Referenzgenom ab und unterscheiden dabei sicher biologische Variationen von Fehlern. Genauer gesagt „basieren“ Sequenzierungsplattformen oder erstellen Auslesungen der Nukleotidfragmente aus den Rohsignalen, die der Sequenzierer aus den verarbeiteten RNA-Proben generiert. Diese basengenannten Fragmente werden verglichen und mit einer Datenbank abgeglichen, um die genomische Taxonomie des Fragments zu identifizieren. Während dieses Kartierungsprozesses breiten sich Unterschiede zwischen der analysierten Probe und dem Referenzgenom aus. Diese Unterschiede in den Messwerten können entweder auf echte genetische Mutationen oder auf fehlerhaftes Basecalling zurückzuführen sein, wobei letzteres entweder durch den Sequenzer selbst oder durch unzureichendes Nukleinsäurematerial verursacht werden könnte. Durch Erhöhen der Anzahl der als Base bezeichneten Fragmente wird diese problematische Überlappung mit größeren Lesetiefen verdeutlicht und das Vertrauen erhöht, dass erkannte Variationen biologisch und kein Artefakt sind11,12,13,14,15.

Die Oxford Nanopore MinION-Sequenzierungsplattform ist eine kompakte Sequenzierungstechnologie der dritten Generation mit geringer Komplexität, die die normalerweise mit der Sequenzierung verbundenen Vorlaufkosten erheblich reduziert hat. Obwohl diese Technologie viele attraktive Vorteile bietet, ist der nutzbare klinische Probenpool aufgrund von Empfindlichkeits- und Genauigkeitseinschränkungen auf Proben mit höherem Titer beschränkt29,30,31. Wir sahen diese Einschränkung als Gelegenheit, mögliche Anreicherungsstrategien zu untersuchen, um die Menge des zu sequenzierenden Nukleinsäurematerials zu erhöhen und so den verfügbaren Pool an klinischen Proben zu vergrößern. Zu diesem Zweck haben wir eine auf magnetischen Hydrogelpartikeln (Nanotrap-Partikel) basierende Front-End-Methode zum Einfangen und Konzentrieren von Viren sowohl auf künstliche VTM- als auch auf diagnostische Restproben angewendet.

Magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) verbesserten die Sequenzierungsergebnisse erheblich, indem sie SARS-CoV-2 aus künstlichen Proben einfingen und konzentrierten, wodurch die Leistung von zwei Standard-RNA-Extraktionsmethoden verbessert wurde. Darüber hinaus haben wir einen allgemeinen Arbeitskonzentrationsbereich von SARS-CoV-2 identifiziert, in dem Nanotrap-Partikel nachweislich die viralen kartierten Lesevorgänge der ONT Mk1C-Sequenzierungsplattform signifikant erhöhen. Sequenzierungs- und RT-PCR-Verbesserungen wurden für beide Nanotrap-Partikel-Workflows 1 und 2 festgestellt. Im Vergleich zu den Ergebnissen, die die RNA-Extraktionskits ohne Nanotrap-Partikel-Vorverarbeitung lieferten, verbesserten beide Workflows die gesamten viral kartierten Messwerte von SARS-Cov-2 um ein Vielfaches erheblich Konzentrationen. Von den beiden Arbeitsabläufen wurden größere Verbesserungen beim säulenbasierten Nanotrap Particle Workflow 1 gegenüber seinem Vergleichsgerät festgestellt. Bei diesem Arbeitsablauf wurde ein größeres Probenvolumen verwendet, was im Vergleich zum Komparator eine stärkere Anreicherung ermöglichte.

Beim Ansatz des auf Magnetkügelchen basierenden RNA-Extraktionskits waren die viralen Kartierungswerte im Allgemeinen bei allen Konzentrationen für Proben, die mit und ohne Nanotrap-Partikel verarbeitet wurden, höher als bei den säulenbasierten RNA-Extraktionen. Dies deutet auf eine höhere RNA-Extraktionseffizienz des Magnetkügelchen-Extraktionskits hin, das einen höheren Prozentsatz an RNA bindet und eluiert. RT-PCR-Ergebnisse stützten diese Theorie; Wir haben beobachtet, dass der Magnetkügelchen-Ansatz den Nachweis von SARS-CoV-2 in einer zehnfach niedrigeren Konzentration ermöglichte als der säulenbasierte Ansatz. Die viral kartierten Messwerte waren bei Nanotrap Particle Workflow 2 höher als bei Nanotrap Particle Workflow 1, obwohl der Konzentrationsbereich, für den Nanotrap-Partikel die Anzahl der Messwerte deutlich verbesserten, bei beiden Workflows ähnlich war, was zu besseren Sequenzierungsergebnissen für die Proben mit höherer Konzentration führte. Während diese höheren Konzentrationen bei der herkömmlichen Sequenzierung ohne Voranreicherung in der Regel weniger problematisch sind, kann die Verbesserung von Proben mit hohem Titer dennoch nützlich sein, da die Sequenzierungstiefe schneller erreicht werden kann und so die für die erfolgreiche Sequenzierung und Analyse dieser Probentypen erforderliche Zeit verkürzt wird. RT-PCR-Ergebnisse zeigten, dass die Nanotrap-Partikelanreicherung bei Proben mit niedrigerer Konzentration für beide Arbeitsabläufe wirksam war, was darauf hindeutet, dass Nanotrap-Partikel auf einer alternativen Sequenzierungsplattform mit höherer Gesamtempfindlichkeit auch die Sequenzierung dieser Virusproben mit niedrigerem Titer verbessern könnten.

Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Arbeitsabläufe mit Nanotrap-Partikeln die Sequenzierung und RT-PCR-Ergebnisse klinisch relevanter diagnostischer Restproben im Vergleich zu Arbeitsabläufen ohne Nanotrap-Partikel verbessern. Es scheint, dass Nanotrap-Partikel die Ergebnisse der Restsequenzierung diagnostischer Proben deutlich verbessern als künstliche VTM-Proben. Die in dieser Studie verarbeiteten Proben wurden ausgewählt, um eine klinisch relevante Kohorte mit Ct-Werten zwischen 24 und 35 darzustellen. Es schien keine enge Korrelation zwischen den Ct-Werten und dem Nutzen der Nanotrap-Partikelanreicherung zu bestehen. Interessanterweise profitierten die meisten diagnostischen Restproben unabhängig von der Viruskonzentration von der Nanotrap-Partikelanreicherung. Diese Verbesserung ist umso überzeugender, wenn man die theoretische Anreicherung berücksichtigt, die sich aus dem Unterschied im Probeneingabevolumen ergibt. Für Workflow 1 und 3 erwarteten wir eine Verbesserung von 10 × oder 2,5 × im Vergleich zu den Proben, die ohne Nanotrap-Partikel verarbeitet wurden. Dies wurde jedoch weit übertroffen, da wir eine Anreicherung der viralen Kartierungswerte der diagnostischen Restproben um mehr als das 40-fache beobachteten. Wir gehen davon aus, dass von Menschen gesammeltes VTM in der Regel größere biologische Rückstände enthält. Daher ist es wahrscheinlicher, dass Arbeitsabläufe ohne Nanotrap-Partikel durch Hemmung beeinträchtigt werden, während die Vorverarbeitung der Nanotrap-Partikel dieses schädliche Material durch zusätzliche Probenreinigung reduziert. Es ist möglich, dass die Nanotrap-Partikelarchitektur das Einfangen des interessierenden Virusmaterials ermöglicht und gleichzeitig Wirtszelltrümmer und anderes kontaminierendes Material reduziert. Der hier bewertete Workflow zur Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek basierte auf einem Polymerase-basierten Amplifikationsschritt, der durch menschliches Zellmaterial negativ beeinflusst werden könnte. Das Bereinigen von Hintergrundmaterial bei gleichzeitiger Erfassung und Konzentration von Virusmaterial würde es dem Nanotrap-Workflow ermöglichen, diesen Amplifikationsschritt noch weiter zu verbessern und so insgesamt größere virale Kartierungswerte für diagnostische VTM-Restproben zu generieren. Darüber hinaus wurde diese Anreicherung bei Proben mit niedrigeren Ct-Werten beobachtet, Proben, die typischerweise die qPCR-Kriterien erfüllen würden, die eine „nützliche“ Probe für die Sequenzierung vorschreiben, aber in der Praxis immer noch Schwierigkeiten haben, brauchbare Sequenzierungsergebnisse zu erzielen. Dies könnte darauf hindeuten, dass der Arbeitsablauf mit magnetischem Hydrogel nicht nur für Proben mit niedrigem Titer nützlich sein könnte, sondern auch für klinische Proben mit höheren Konzentrationen, bei denen die Sequenzierung fehlschlägt.

Nanofallenpartikel verbesserten die viral kartierten Messwerte einer großen Mehrheit der diagnostischen Restproben für beide Arbeitsabläufe erheblich. Infolgedessen erhöhte sich auch die virale Genomabdeckung für einen Großteil der diagnostischen Restproben und stieg bei bestimmten diagnostischen Restproben um 80 %. Diese Daten deuten darauf hin, dass Nanofallenpartikel den Anteil der Proben, die für die Sequenzierung verwendet werden könnten, erheblich erhöhen könnten, obwohl zur Bestätigung ein größerer Probensatz durchgeführt werden sollte. Es ist erwähnenswert, dass einige der Proben, bei denen es bei Verwendung der Nanotrap-Partikel keine statistisch signifikante Verbesserung gab, bei der Verarbeitung ohne Nanotrap-Partikel bereits eine relativ vollständige Genomabdeckung aufwiesen.

Um den praktischen Nutzen der durch die Verwendung der Nanotrap-Partikel beobachteten Verbesserung weiter zu bewerten, haben wir auch Sequenzierungsdaten mit Pangolin und Nextclade analysiert, zwei Bioinformatik-Tools, die weltweit häufig zur Verfolgung und Analyse von SARS-CoV-2-Varianten verwendet werden32,33,34. Diese Tools wurden aufgrund ihrer Fähigkeit zur Erkennung und Klassifizierung von Mutationen, ihrer Datenanforderungen für eine erfolgreiche Variantenanalyse und ihrer jeweiligen qualitativen Metriken, die die Informationsqualität bestimmen, ausgewählt. Dies lieferte ein Bewertungssystem, mit dem wir besser bestimmen konnten, wie wirkungsvoll die Nanotrap-Partikelanreicherung für Sequenzierungsdaten ist. Wir haben festgestellt, dass bei einem Großteil der getesteten diagnostischen Restproben der Nanotrap-Partikelprozess eine effektivere Arbeit dieser Bioinformatik-Tools ermöglichte und es bei bestimmten Proben mit niedrigem Titer sowohl Pangolin als auch Nextclade ermöglichte, eine erfolgreiche Analyse durchzuführen, die andernfalls fehlgeschlagen wäre zu unzureichenden Daten. Nextclade war außerdem in der Lage, das gesamte SARS-CoV-2-Genom für Nanotrap-Proben besser zu kartieren und im Vergleich zur [− NT]-Kontrolle insgesamt mehr Mutationen pro Probe zu identifizieren. Dies deutet darauf hin, dass Nanotrap-Partikel es Forschern möglicherweise ermöglichen, Varianten effektiver zu verfolgen und zu erkennen, die ohne die erhöhte Empfindlichkeit des Nanotrap-Partikelprozesses unentdeckt bleiben würden.

Damit die Sequenzierung im öffentlichen Gesundheitswesen nützlicher wird, müssen Aspekte des Probendurchsatzes und des Arbeitsablaufs berücksichtigt werden. Automatisierte Systeme wie die KingFisher-Automatisierungsplattform sind leicht skalierbar und werden bereits als Verarbeitungstool in klinischen Labors eingesetzt35. Nanotrap-Partikel verbesserten die Sequenzierungsergebnisse von zehn positiven diagnostischen Restproben, wenn sie mit Nanotrap Workflow 3 verarbeitet wurden, und demonstrierten damit ihre Nützlichkeit in einem automatisierten System mit hohem Durchsatz. Es ist erwähnenswert, dass diese automatisierte Methode die Verarbeitung von 96 Proben in 1 Stunde ermöglichen würde, was wesentlich schneller und weitaus benutzerfreundlicher ist als die manuelle Säulenextraktionsmethode, was sie zu einem attraktiven Angebot für Labore mit mittlerem bis hohem Durchsatz macht.

Zusätzlich zu SARS-CoV-2 haben Nanotrap-Partikel nachweislich ihre Verwendung bei der Erfassung einer breiten Palette von Viren, einschließlich Atemwegserregern17,18,19,20,21. Bisher wurden jedoch noch nie virale Sequenzierungsdaten veröffentlicht, wenn ein Nanotrap-Partikel-Workflow verwendet wurde. Hier haben wir frühere Berichte bestätigt, die zeigen, dass Nanotrap-Partikel auch Influenza A und RSV, zwei häufige Atemwegsviren, einfangen und konzentrieren können. Wir haben außerdem gezeigt, dass unser Nanotrap-Partikel-Workflow mit der Sequenzierung mehrerer Atemwegserreger kompatibel ist, wodurch sich die viral kartierten Messwerte beider Viren erhöhen. Dies legt nahe, dass Nanotrap-Partikel-Workflows zur Verbesserung der umfassenden Viruserkennung durch Sequenzierung eingesetzt werden können.

Diese Studie weist bestimmte Einschränkungen auf, beginnend mit der Anzahl der untersuchten Proben. Es wurde eine ausreichende Anzahl von Replikaten getestet, um eine positive Verbesserung durch den Nanotrap-Partikelprozess bei der Sequenzierung von VTM-Proben festzustellen. Es sollten jedoch mehr Proben durchgeführt werden, um die durch den Arbeitsablauf mögliche Faltenanreicherung besser und genauer quantifizieren zu können. Wir haben auch nicht direkt die Fähigkeit der Nanotrap-Partikel bewertet, die Sequenzierung verschiedener SARS-CoV-2-Varianten zu verbessern. Angesichts der allgemeinen viralen Einfangeigenschaften der Nanotrap-Partikel gehen wir jedoch davon aus, dass die beim Wildtyp-SARS-CoV-2 beobachteten Sequenzierungsverbesserungen den Verbesserungen bei den meisten anderen SARS-CoV-2-Varianten entsprechen würden. Zukünftige Experimente könnten diese Hypothese überprüfen, indem sie die Nanotrap-Partikelanreicherung von Proben mit bekannten Varianten auf der Grundlage einer verbesserten Detektion bewerten. Wir könnten auch einen Testpool diagnostischer Restproben mit bekannten Varianten bei niedrigeren Titern erstellen, um zu untersuchen, ob der Nanotrap-Partikel-Workflow die Anzahl der verfügbaren klinischen Proben für die Sequenzierung gleichzeitig erhöhen kann. Da außerdem nur künstlich hergestellte Influenza-A- und RSV-Proben untersucht wurden, können wir zum jetzigen Zeitpunkt nicht definitiv behaupten, dass das Nanotrap-Partikelverfahren in der Lage ist, diese Atemwegserreger in biologisch komplexeren Medien zu sequenzieren. Wir haben auch nicht untersucht, was in Proben geschieht, die mit mehreren Viren koinfiziert sind. Dies könnte die Nanofallen-Partikel möglicherweise auf ein bestimmtes Virus ausrichten, wenn dieses Virus eine höhere Affinität zu den Nanofallen-Partikeln aufweist als andere. Zukünftige Experimente sollten untersuchen, wie sich Nanotrap-Partikel in einer koinfizierten Probe verhalten, und gleichzeitig klinisch relevantere diagnostische Restproben verwenden, die Influenza A oder RSV enthalten. Es besteht auch Raum für die Erforschung zusätzlicher Anwendungen dieses Ansatzes bei alternativen Probentypen, einschließlich Mundflüssigkeit (die für weniger invasive virale Atemwegstests verwendet werden könnte) und Abwasser (die zur Überwachung viraler Atemwegserreger in Gemeinden verwendet werden könnte). Zukünftig planen wir, uns mit jedem dieser Bereiche zu befassen, damit wir weiterhin Anwendungen zur Virusüberwachung mit dieser vielseitigen Anreicherungstechnologie untersuchen können.

Insgesamt zeigt diese Studie, dass die Anreicherung magnetischer Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) die Sequenzierung anspruchsvoller klinischer Proben in VTM mit dem ONT MinION Sequencer ermöglicht, Proben, die sonst möglicherweise nicht für die Sequenzierung geeignet gewesen wären. Da unsere Methode keine Filtrations- oder Zentrifugationsschritte erfordert, ist dieser Ansatz mit Umgebungen mit mittlerem und hohem Durchsatz kompatibel, einschließlich der KingFisher-Automatisierungsplattform. Darüber hinaus ermöglicht eine Konzentrationsmethode für magnetische Hydrogelpartikel (Nanotrap-Partikel) in Kombination mit einer ONT-Sequenzierungsplattform leichter zugängliche Sequenzierungsbemühungen. Angesichts der relativ geringen Kosten und Portabilität beider Technologien könnte dieses kombinierte System möglicherweise in Bereichen mit begrenzten Laborressourcen und begrenztem Zugang zu traditionelleren Sequenzierungsgeräten eingesetzt werden.

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Diese Veröffentlichung wurde durch den SBIR Grant 1 R43IP001142-01 der Centers for Disease Control and Prevention und durch die NIH Rapid Acceleration of Diagnostics (RADxSM)-Initiative unterstützt, die ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering finanziert wurde , National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, unter Vertragsnummer 75N92020C00021. Für den Inhalt sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention oder der National Institutes of Health wieder.

P. Andersen

Aktuelle Adresse: Ceres Nanosciences, Inc., Manassas, VA, 20110, USA

Ceres Nanosciences, Inc., Manassas, VA, 20110, USA

Barksdale S, RA Barclay, N Smith, J Fernandes, K Besse, D Goldfarb, R Barbero, R Dunlap, R Jones-Roe, R Kelly, S Miao, C Ruhunsiri, A. Munns, S. Mosavi, L. Sanson, D. Munns, S. Sahoo, O. Swahn, K. Hull, D. White, K. Kolb, F. Noroozi, J. Seelam, A. Patnaik und B. Lepene

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PA, NS, DG, JF und KB führten die Experimente durch und trugen zur Viruseinfangung, Virusextraktion und Viruserkennung bei. AP, DM, SM, SS, RK, CR, SM, DW, JS, FN, OS, AM, KK und KH trugen zur Produktion und Qualitätskontrolle der Nanotrap®-Partikel bei. PA, RB, TJ, BL, SB, RD und RAB trugen zur Datenpräsentation und -formatierung bei. PA, SB, RAB und BL analysierten und interpretierten die Daten und waren an der Versuchsplanung beteiligt. PA, RB, TJ, BL, SB, RD und RAB waren an der Erstellung und Bearbeitung des Manuskripts beteiligt und übernahmen gleichzeitig die Gesamtleitung und Koordination dieser Studie. Alle Autoren stimmten dem Manuskript zu.

Korrespondenz mit P. Andersen oder B. Lepene.

PA, SB, RAB, NS, JF, KB, DG, RB, RD, TJR, RK, SM, CR, AM, SM, LS, DM, SS, OS, KH, DW, KK, FN, JS, AP, BL sind Mitarbeiter bei Ceres Nanosciences Inc.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Andersen, P., Barksdale, S., Barclay, R. et al. Magnetische Hydrogelpartikel verbessern die Nanoporensequenzierung von SARS-CoV-2 und anderen Atemwegsviren. Sci Rep 13, 2163 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29206-7

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Eingegangen: 18. April 2022

Angenommen: 31. Januar 2023

Veröffentlicht: 07. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29206-7

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